一、引言
骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為一種具有多向分化潛能和自我更新能力的成體干細胞，在組織工程、再生醫學和細胞治療等領域展現出巨大的應用前景。大鼠是常用的實驗動物模型，其 BMSCs 的研究對于人類相關疾病和治療策略的探索具有重要的參考價值。綠色熒光蛋白（GFP）作為一種廣泛應用的報告基因，能夠在不影響細胞生理功能的情況下，實現對轉染細胞的可視化追蹤。因此，成功將 GFP 基因轉染至大鼠 BMSCs 對于深入研究 BMSCs 在體內的分布、遷移、分化等生物學過程至關重要。然而，BMSCs 具有更好的細胞特性，其轉染過程面臨著諸多挑戰，如轉染效率低、細胞毒性等問題。本研究旨在探索優化的大鼠 BMSCs GFP 轉染方案，為相關領域的研究奠定堅實的實驗基礎。
二、材料與方法
（一）實驗動物
選取健康的成年 SD 大鼠（體重 200 - 250g），雌雄不限。所有大鼠均飼養于標準的動物實驗環境中，保持適宜的溫度、濕度和光照周期，自由飲水和進食。
（二）大鼠骨髓間充質干細胞的分離與培養
骨髓采集
通過頸椎脫臼法處死大鼠，在無菌條件下分離股骨和脛骨。用含有肝素（100 U/mL）的 PBS 沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液。
細胞分離與培養
將骨髓細胞懸液緩慢加入到密度為 1.073 g/mL 的淋巴細胞分離液上，進行密度梯度離心（2000 rpm，20 分鐘）。吸取中間的單個核細胞層，用 PBS 洗滌兩次（1000 rpm，5 分鐘）。然后，將細胞重懸于含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 鏈霉素的低糖 DMEM 培養基中，接種于培養瓶中，置于 37℃、5% CO?的培養箱中培養。24 小時后第一次換液，去除未貼壁的細胞，以后每 3 - 4 天更換一次培養基。
（三）綠色熒光蛋白轉染實驗
轉染試劑及載體
選用了兩種常見的轉染試劑，脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亞胺（PEI），以及攜帶綠色熒光蛋白基因（GFP）的質粒載體。質粒載體在使用前需進行大量提取和純化，確保其質量和純度符合轉染要求。
轉染前細胞準備
當 BMSCs 生長至 70 - 80% 匯合度時，進行轉染。在轉染前一天，將細胞接種于 6 孔板或 24 孔板中，每孔細胞數量根據板的規格進行調整，以保證轉染時細胞密度適宜。同時，更換新鮮的培養基，確保細胞處于良好的生長狀態。
脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 轉染方法
按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作。首先，將適量的質粒 DNA（根據不同的實驗條件設置不同的量，范圍從 0.5 - 2μg）稀釋于無血清的 Opti - MEM 培養基中，輕輕混勻。然后，將 Lipofectamine 2000 試劑在另一管 Opti - MEM 培養基中稀釋，室溫孵育 5 分鐘。之后，將稀釋后的 DNA 溶液與 Lipofectamine 2000 溶液輕輕混合，室溫孵育 20 分鐘，形成轉染復合物。最后，將轉染復合物逐滴加入到含有細胞的孔中，輕輕晃動培養板，使復合物均勻分布。將培養板置于 37℃、5% CO?的培養箱中繼續培養。
聚乙烯亞胺（PEI）轉染方法
對于 PEI 轉染，將 PEI 與質粒 DNA 按照不同的質量比（N/P 比，范圍從 5 - 20）進行混合。先將質粒 DNA 稀釋于適量的 PBS 中，然后將 PEI 溶液緩慢加入到 DNA 溶液中，輕輕混勻，室溫孵育 15 - 30 分鐘，形成轉染復合物。將復合物加入到細胞培養孔中，操作過程與脂質體轉染類似。轉染后的細胞同樣置于 37℃、5% CO?的培養箱中培養。
（四）轉染效率及細胞活性檢測
熒光顯微鏡觀察
在轉染后 24、48 和 72 小時，使用熒光顯微鏡觀察細胞的 GFP 表達情況。隨機選取多個視野，計算每個視野中 GFP 陽性細胞的比例，以此評估轉染效率。同時，觀察細胞的形態和生長狀態，初步判斷轉染對細胞的影響。
流式細胞術分析
收集轉染后的細胞，用胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液。通過流式細胞儀檢測 GFP 陽性細胞的比例，進一步精確評估轉染效率。同時，檢測細胞的活性指標，如細胞凋亡率等，以評估轉染試劑和過程對細胞的毒性作用。
細胞增殖能力檢測
采用 CCK - 8 法檢測轉染后細胞的增殖能力。在轉染后的不同時間點（0、24、48、72 小時等），向細胞培養孔中加入 CCK - 8 試劑，按照試劑盒的說明書操作，在酶標儀上測定吸光度值（OD 值）。根據 OD 值繪制細胞增殖曲線，分析轉染對細胞增殖的影響。
三、結果
（一）大鼠骨髓間充質干細胞的培養與鑒定
經過密度梯度離心和培養，成功從大鼠骨髓中分離出 BMSCs。原代培養的 BMSCs 在接種 24 小時后開始貼壁，呈梭形或多角形。隨著培養時間的延長，細胞逐漸增殖并形成集落。傳代培養后，細胞形態保持穩定，生長狀態良好。通過流式細胞術對細胞表面標志物進行檢測，結果顯示培養的 BMSCs 高表達間充質干細胞標志物 CD29、CD44 和 CD90，低表達造血干細胞標志物 CD34 和 CD45，證明所培養的細胞為 BMSCs。
（二）不同轉染試劑和條件下的轉染效率
脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000
在不同的 DNA 量條件下，轉染效率有所不同。當 DNA 量為 1μg 時，轉染后 24 小時，熒光顯微鏡下觀察到部分細胞表達 GFP，轉染效率約為 20%；48 小時后，轉染效率有所提高，達到約 35%；72 小時時，轉染效率可達 40% 左右。通過流式細胞術分析結果與熒光顯微鏡觀察基本一致，且在該轉染條件下，細胞凋亡率較低，細胞形態和增殖能力在轉染后短時間內未受到明顯影響。
聚乙烯亞胺（PEI）
不同 N/P 比下，PEI 的轉染效率存在差異。當 N/P 比為 10 時，轉染后 24 小時轉染效率約為 15%，48 小時后提高到約 30%，72 小時可達約 38%。隨著 N/P 比的增加，轉染效率有一定提高，但細胞凋亡率也相應增加。在 N/P 比為 20 時，雖然轉染效率可達到約 45%，但細胞凋亡明顯增加，細胞增殖能力受到顯著抑制。
（三）細胞活性檢測結果
流式細胞術檢測細胞凋亡
脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 轉染后的細胞凋亡率在轉染后 24 小時約為 5%，48 小時約為 8%，72 小時約為 10%。而 PEI 轉染的細胞在不同 N/P 比下凋亡率不同，N/P 比為 10 時，24 小時凋亡率約為 8%，48 小時約為 12%，72 小時約為 15%；N/P 比為 20 時，24 小時凋亡率可達約 15%，48 小時約為 20%，72 小時約為 25%。
CCK - 8 法檢測細胞增殖
脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 轉染后的細胞在轉染后 48 小時內增殖能力與未轉染細胞相比無明顯差異，但在 72 小時時增殖速度略有減慢。PEI 轉染的細胞在 N/P 比為 10 時，48 小時后增殖能力開始受到一定影響，而在 N/P 比為 20 時，細胞增殖在轉染后 24 小時就明顯受到抑制。
四、討論
（一）大鼠骨髓間充質干細胞培養的優化
在本研究中，通過密度梯度離心法成功從大鼠骨髓中分離出 BMSCs，并在適宜的培養條件下實現了穩定的培養。在細胞培養過程中，培養基的選擇、血清濃度以及培養環境等因素對于 BMSCs 的生長和增殖至關重要。低糖 DMEM 培養基和 10% FBS 的組合能夠滿足 BMSCs 的營養需求，同時減少細胞分化的可能性。此外，第一次換液時間的選擇也會影響細胞的純度和生長狀態，本研究在 24 小時后換液有效地去除了未貼壁的血細胞等雜質。
（二）轉染試劑和條件對轉染效率的影響
脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000
Lipofectamine 2000 作為一種常用的轉染試劑，在本研究中表現出較好的轉染效率和較低的細胞毒性。其轉染效率隨著時間的延長而提高，這可能是由于隨著時間推移，更多的質粒 DNA 進入細胞核并實現基因表達。合適的 DNA 量對于轉染效率和細胞活性的平衡至關重要，本研究中 1μg 的 DNA 量在保證一定轉染效率的同時，對細胞的損傷較小。
聚乙烯亞胺（PEI）
PEI 的轉染效率與 N/P 比密切相關。在一定范圍內，隨著 N/P 比的增加，轉染效率提高，但同時細胞毒性也增加。這是因為高 N/P 比下，PEI 與 DNA 形成的復合物可能會對細胞產生更大的物理和化學刺激，導致細胞凋亡增加和增殖能力下降。因此，在使用 PEI 轉染時，需要綜合考慮轉染效率和細胞活性，選擇合適的 N/P 比。
（三）轉染對細胞生物學行為的影響
轉染過程不僅影響轉染效率，還會對細胞的生物學行為產生影響，如細胞凋亡和增殖。本研究結果表明，不同的轉染試劑和條件對細胞凋亡和增殖的影響不同。脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 對細胞的影響相對較小，而 PEI 在高 N/P 比時對細胞的損傷較為明顯。這提示我們在進行轉染實驗時，需要全面評估轉染對細胞的影響，以確保轉染后的細胞能夠保持其生物學功能，滿足后續實驗的要求。
五、結論
本研究成功建立了大鼠骨髓間充質干細胞的培養體系，并對其進行了綠色熒光蛋白轉染實驗。通過比較脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亞胺（PEI）在不同條件下的轉染效率和對細胞活性的影響，發現 Lipofectamine 2000 在較低的 DNA 量下能夠獲得較好的轉染效率且對細胞毒性較小，而 PEI 在合適的 N/P 比下也可實現較高的轉染效率，但需要注意其細胞毒性。本研究結果為進一步利用大鼠骨髓間充質干細胞進行細胞追蹤、組織工程和再生醫學等領域的研究提供了重要的實驗依據和技術支持，同時也為優化 BMSCs 轉染方案提供了參考。在未來的研究中，可以進一步探索新的轉染技術和方法，以提高轉染效率和降低細胞毒性，更好地發揮 BMSCs 在生物醫學研究中的作用。
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