(4)顯色和比色

TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達ding峰，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可wan全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24 小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。酶標儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15 -30℃ ，使用前先預(yù)熱儀器 15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

測讀 A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結(jié)果一致性。

(5)HooK效應(yīng)影響

隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。

(6)干擾物質(zhì)的影響

有人認為大約 40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果;常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP(如孕婦)，在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。

(7)藥物的影響

高效價的乙肝免疫球蛋白會與 HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出;而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg 陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物;則新生兒HBsAg檢測呈陰性;用0.5M的鹽酸處理標本1小時可提高出率。 為預(yù)防乙肝，部分 HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出;如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測。

(8)抗原自身因素

融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷 試劑 盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標本。少數(shù) HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之間。據(jù)文獻報道，到目前為止在獻血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg 攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml。含量高者可達2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構(gòu)成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs應(yīng)答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預(yù)防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。近來，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變(氨基酸58～118)是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。

總之，優(yōu)質(zhì)的 試劑，良好狀態(tài)的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。