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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10396P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
人類白細胞抗原A基因染料法PCR試劑盒
產(chǎn)品名稱：人類白細胞抗原A基因染料法PCR試劑盒
英文名稱：Human Leukocyte Antigen-A(HLA-A)SYBR qPCR Kit
人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人類的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的表達產(chǎn)物，該系統(tǒng)是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)。 根據(jù)基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，功能，細胞分布等因素，將 HLA 基因分成了 3 大類，其中 HLA-I 型基因，包括了 HLA-A，HLA-B，HLA-C 等經(jīng)典的抗原基因。本產(chǎn)品就是以熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測 HLA-A 基因的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 特異性高，引物是根據(jù) HLA-A 基因高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他基因。
3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。
4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。
6.本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 500μL（棕色） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL（白蓋） |
HLA-A 基因染料法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 1mL（綠蓋） |
核酸釋放劑試用裝 | 1mL（綠蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 RNA。
【注意事項】
一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。本試劑盒免費贈送1ml免DNA提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果進行定量分析，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
10.在標記管中按下表加入各成分：
成分 | N+2 個 樣品管 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
HLA-A 基因染料法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 個待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自備超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
不加 |
不加 | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3號管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX，則用水替代。
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)
過程 | 溫度 | 時間 |
預(yù)熱 | 50℃ | 2 min |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 SYBR 通道的熒 光信號） | |
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析 | ||
五、數(shù)據(jù)處理
12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。
13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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