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| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10379P | 應用領域 | 化工,生物產業 |
| 主要用途 | 科研實驗 | 英文名稱 | African Swine Fever Virus(ASFV) Probe PCR Kit |
| 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 | 有效期 | 12個月 |
| 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
非洲豬瘟病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
商品名稱：非洲豬瘟病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
Name ：African Swine Fever Virus(ASFV) Probe PCR Kit
非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)會引起非洲豬瘟等急性、出血性、烈性傳染病，其特征是發病過程短，最急性和急性感染死亡率高達100%，臨床表現為發熱(達40~42℃），心跳加快，呼吸困難，部分咳嗽，眼、鼻有漿液性或粘液性膿性分泌物，皮膚發紺，淋巴結、腎、胃腸粘膜明顯出血，非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟癥狀相似，只能依靠實驗室監測確診，對養豬業造成嚴重損害，因此快速檢測非洲豬瘟病毒具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經過優化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據非洲豬瘟病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的DNA發生交叉反應。
5.本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
6.本產品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 0.5 mL（本色蓋） |
熒光PCR專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
非洲豬瘟病毒PCR引物 | 100 μL（白蓋） |
非洲豬瘟病毒qPCR探針 | 100 μL（棕色管） |
非洲豬瘟病毒陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 50 μL（紅蓋） |
核酸釋釋劑試用裝 | 50次（2.5mL） |
使用手冊 | 1份 |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】樣品 DNA。
【使用方法】
一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，最好設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span>10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA/提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
9. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。
在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽
10. 性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
非洲豬瘟病毒 qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
非洲豬瘟病毒 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5 min |
PCR反應 （40個循環） | 94℃ | 0.5 min |
55℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | |
72℃ | 0.5 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
四、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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