7月13日，由石河子大學動物科技學院皮文輝研究員團隊培育的兩只羊寶寶“強強"“壯壯"迎來滿月。皮教授團隊使用NEPA21高效基因轉染系統（NEPA GENE），通過電穿孔技術將Cas9 RNPs成分遞送入綿羊體外受精胚胎，成功敲除了肌肉生長抑制素（MSTN）基因，從而獲得了具有更好肌肉品質和更高產肉量的基因編輯綿羊。

此學術論文已在國際科學期刊《International Journal of Molecular Sciences》上發表，題為“Electroporation Delivery of Cas9 sgRNA Ribonucleoprotein Mediated Genome Editing in Sheep IVF Zygotes"。

目前，顯微注射和電穿孔是兩種常用于將CRISPR/Cas9傳遞到哺乳動物受精卵中的技術。雖然顯微注射技術精確且可重復，但它操作復雜，每次注射的目標有限，成本昂貴并且需要廣泛的技術培訓，不適合大規模應用。相比之下，電穿孔技術作為一種更高效、可擴展的基因組編輯方法正逐步流行，它簡化了操作過程，提高了胚胎存活率、轉染率和發育潛力。多種動物模型，包括大鼠、小鼠、牛和豬，已經成功地通過電穿孔CRISPR/Cas9系統進行了基因修飾。

在本研究中，作者設計了五個實驗，以羊的ACTG1和MSTN基因為對象，通過使用NEPA21高效基因電轉染系統（NEPA GENE）探索了不同電轉染參數對基因編輯效率的影響。在實驗1中，研究者設置了三組不同的電穿孔參數（40V,3.5ms；41V,3.5ms；42V,3ms）來研究它們對綿羊受精卵分裂和囊胚形成率的影響（見表1和圖1）。他們使用sf-Cas9 RNPs靶向綿羊的ACTG1基因位點，并評估了在三種不同電穿孔參數下的基因編輯效率。電穿孔在受精后6小時進行，結果顯示，最佳的電穿孔電壓和脈沖長度組合為40~42V和3.0~3.5ms。此外，更強的電場可能需要配合更短的脈沖持續時間，以實現高效基因編輯而不損傷受精卵。

圖1.針對綿羊ACTG1基因的靶向后，分裂和囊胚率（均值±標準差）。不同字母表示顯著差異（p<0.05）。藍色條表示IVF后的受精卵分裂率。綠色條表示囊胚形成率。

在實驗2中，作者探究了三種不同的Cas9 RNPs組分對綿羊電穿孔受精卵突變的影響。作者使用了40V、3.5ms的電穿孔參數，直接電轉染與sgRNA預孵育的sf-Cas9 RNPs，發現這可以提高基因編輯效率。結果表明，Cas9 RNPs中sgRNA的高飽和度能顯著提高基因編輯的成功率。研究者比較了三組不同成分RNP轉染后囊胚編輯效率：

1、單獨使用自組裝Cas9 RNPs的組別，突變效率為30.28%±9.14%（見圖2）。

2、使用合成靶向sgRNAs預孵育的sf-Cas9 RNPs組別（sf-Cas9 RNPs+sgRNA），突變效率顯著更高，達到87.78% ±10.72%（見圖2）。

3、entirely體外組裝的Cas9 RNPs組別，效率為82.14%±15.57%（見圖2）。

實驗結果表明，在進行電穿孔之前，將Cas9蛋白與sgRNA預先孵育，可以顯著提高綿羊受精卵基因編輯的突變效率。

圖2.三種Cas9 RNPs對綿羊囊胚編輯突變率的影響（ACTG1位點）

在實驗3中，作者通過電穿孔傳遞Cas9 RNPs至綿羊MSTN基因位點，提高了突變效率。使用體外組裝的Cas9 RNPs，并設置了兩組不同的電穿孔參數：（40V,3.5ms）和（42V,3ms），將Cas9 RNPs轉染到綿羊受精卵中。結果顯示，電穿孔顯著提高了綿羊囊胚中基因組靶標的突變率，且這種增加是顯著的（p<0.01，見圖3）。在這兩組電穿孔參數下，有非常高比例的囊胚表現出突變，突變率分別為84.55%±1.19%和82.83%±0.87%（見圖3）。

這些發現表明，所測試的兩組電穿孔參數都適合于IVF綿羊受精卵的基因編輯，能夠有效地提高基因編輯的效率。

圖3.綿羊MSTN基因靶向后的突變率（均值±標準差）

在實驗4中，作者探索了Cas9 RNPs和單鏈寡核苷酸（ssODNs）的結合對綿羊胚胎基因編輯的影響。作者使用了40V、3.5ms的電穿孔參數來傳遞以下混合物：Cas9蛋白（200ng/µL）、針對MSTN基因位點的sgRNA（300ng/µL）、含有由同源序列flanked的EcoR I和EcoR V位點的ssODNs（420ng/µL），電穿孔后，研究者提取了模板DNA用于聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。然后，他們使用基于PCR產物的測序結果來分析綿羊囊胚的基因分型。實驗結果顯示，小的DNA片段可以通過與Cas9 RNPs的電穿孔有效地插入到綿羊受精卵的目標區域。ssODNs的引入導致囊胚中26%的同源重組率，其中2%的囊胚為純合子。此外，研究還發現增加ssODNs的長度可以進一步提高同源重組的效率。

在實驗5中，研究者將經過MSTN基因編輯的囊胚轉移到受體母羊中。移植成功并生產了兩只雄性羔羊（見圖4）。其中，羔羊1具有斑點毛色，而羔羊2則是純白色。對這兩只羔羊的MSTN基因進行了分析，結果顯示它們的突變率異常高，分別為94.5%和94.9%。這表明通過電穿孔技術處理IVF綿羊受精卵進行基因編輯是成功的。該結果進一步證實了CRISPR/Cas9系統在誘導羔羊中遺傳修飾方面的高效性。MSTN基因是肌肉生長的一個關鍵調節因子，因此該基因的成功編輯可能對提高綿羊的肌肉質量和改善其生產性狀具有重要意義。此外，這項研究表明電轉染技術有潛力成為綿羊養殖業中基因組編輯和育種的有效工具，為未來在畜牧業中應用基因編輯技術提供了有力的證據。

圖4.出生20天后的基因編輯羔羊

NEPA21高效基因轉染系統采用全新設計的電轉程序，配合電壓衰減設計，在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。操作簡單，電轉參數可見可調，適用性強。特別適用于難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、活體動物、受精卵及宮內胚胎等的轉染，多篇文獻支持！咨詢可識別下方二維碼。

參考文獻：

1. Pi, W.; Feng, G.; Liu, M.; Nie, C.; Chen, C.; Wang, J.; Wang, L.; Wan, P.; Liu, C.; Liu, Y.; et al. Electroporation Delivery of Cas9 sgRNA Ribonucleoprotein-Mediated Genome Editing in Sheep IVF Zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9145.

2. Kalds, P.; Zhou, S.; Cai, B.; Liu, J.; Wang, Y.; Petersen, B.; Sonstegard, T.; Wang, X.; Chen, Y. Sheep and Goat Genome Engineering:From Random Transgenesis to the CRISPR Era. Front. Genet. 2019, 10, 750.

3. Wang, J.Y.; Doudna, J.A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science 2023, 379.

4. Wang, X.; Niu, Y.; Zhou, J.; Yu, H.; Kou, Q.; Lei, A.; Zhao, X.; Yan, H.; Cai, B.; Shen, Q.; et al. Multiplex gene editing via
CRISPR/Cas9 exhibits desirable muscle hypertrophy without detectable off-target effects in sheep. Sci. Rep. 2016, 6, 32271.

5. Crispo, M.; Mulet, A.P.; Tesson, L.; Barrera, N.; Cuadro, F.; dos Santos-Neto, P.C.; Nguyen, T.H.; Crénéguy, A.; Brusselle, L.Anegón, I.; et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS ONE 2015, 10.