人誘導多能干細胞iPSC被廣泛用于疾病建模、藥物開發和疾病的細胞治療，隨著基因編輯技術的進一步發展，對疾病誘導多能干細胞進行基因編輯，校正致病基因的突變并用于細胞治療正成為轉化醫學和再生醫學研究的熱點。

CRISPR介導的基因編輯為研究人員提供了一種更快、更有效的方法來編輯細胞中感興趣的關鍵基因。雖然比傳統方法更有效，但基因組編輯過程通常會損害細胞活力，因此從編輯后的單細胞生長成到單克隆細胞團是一個困難的過程。 CRISPR 工作流程的一個主要瓶頸是單細胞克隆。細胞轉染后，產生的細胞群是異質的，具有不同程度的編輯。該群體必須從未轉染的細胞中富集并克隆以創建統一的單克隆細胞系，以便進一步表征以確保進行正確的基因編輯。此外，必須保證基因變化的安全性和可追溯性，特別是在使用轉基因細胞的醫療應用中。這是歐洲藥品管理局 (EMA) 和食品藥品監督管理局 (FDA) 所要求的。

傳統的分選方法如有限稀釋法耗時耗力、效率低下；FACS分選的細胞容易受到鞘液壓力的影響而受損，導致單克隆率低。同時，這兩種方法都無法提供單細胞來源的證明，無法滿足監管部門的要求。Cytena公司的單細胞打印機以噴墨式打印技術溫和而高效的分選單細胞，簡化了基因編輯工作流程，提高了單克隆有效率。

下面小編將闡述Cytena 的single cell printer分別如何提高iPSC的單克隆效率，

如何簡化基因編輯的MSC的工作流程。

CRISPR 基因編輯與人多能干細胞(hPSC)

iPSC是什么？

2006年，日本科學家Yamanaka及其研究小組利用逆轉錄病毒作為載體，向鼠成纖維細胞中導入4個轉錄因子，獲得在形態、基因和蛋白表達、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎干細胞極為相似的細胞，后命名為誘導多能干細胞（induced Pluripotent Stem Cell, iPSC）。次年，該研究小組又成功將人體細胞重編程為iPSC，允許自我更新和分化成人體幾乎所有的細胞類型。

iPSC細胞研究改變了基礎研究的方向和趨勢，Yamanaka也因“將成熟細胞重新編程，轉化為可以分化為多種細胞類型的誘導多能干細胞（iPSC）方面的杰出貢獻"成為2012年諾貝爾生理或醫學獎共同得主。

iPSC應用領域及研究熱點

iPSC的一個關鍵優勢是它們從人類的成體細胞產生，避免了人類胚胎干細胞的倫理爭議，在藥物發現、疾病建模、細胞治療中具有廣泛的應用。為了進一步發揮人iPSC的應用潛能，通過CRISPR/Cas9基因編輯的方法，將疾病發生的突變引入iPSC，或通過iPSC修復疾病模型中的突變，再分化成不同的細胞進行研究或治療，是目前iPSC的研究熱點1。

圖1：iPSC的研究熱點

Cytena單細胞打印機在CRISPR 基因編輯的hPSC單細胞分選中的應用

hPSC對培養環境的變化十分敏感，如pH值、滲透壓、營養供應、機械應力/剪切力等。在傳統的培養條件下，hPSC通常在涂有各種細胞外基質表面上密集生長。在對hPSC基因組編輯過程中，最大的挑戰之一是獲得陽性單克隆細胞。單個hPSC的生長過程中，減少了細胞和細胞之間、細胞與細胞外基質的接觸，容易誘發細胞失巢凋亡，導致單細胞存活率顯著下降。一方面，抑制細胞失巢凋亡的產生，會改善單細胞存活率；另一方面，溫和的自動化分選系統可以進一步優化陽性單克隆細胞的篩選平臺。

德國學者在CurrProtocStemCellBiol上發表文章，分享使用Cytena單細胞打印機分選基因編輯后hPSC單細胞的流程，最終平均每個96孔板獲得30~50個單克隆hPSC2。

圖2：Cytena單細胞打印機篩選單克隆hPSC流程

21年5月，Nature Methods報道能顯著提高hPSC在單細胞克隆過程中存活率的四組分配方CEPT。

相比于流式分選，Cytena單細胞打印機以更溫和的篩選技術提高了單細胞存活率；并利用單細胞打印機驗證CEPT能夠提高不同來源hPSC細胞株在轉染前后的單克隆細胞的存活率，且沒有引起遺傳異常3。

圖3：Cytena單細胞打印機驗證CEPT提高單克隆hPSC活率

l 流式細胞儀和Cytena分選設備分選過程中捕捉噴嘴圖片（圖3d）；比較小分子Y-27632與CEPT處理后hPSC的單克隆有效率，可以發現CEPT處理后克隆有效率更高(圖3b, 3c)；在相同小分子處理下，Cytena分選設備單克隆有效率(圖3c, 3d)比流式分選(圖3a, 3b)高出~20%

l 后續的實驗摸索均使用Cytena分選設備，證實CEPT可以明顯提高hPSC單細胞克隆率(圖3e, 3f)；與 VN 相比，涂有LN521的并含有 StemFlex 培養基的 96 孔板中的hPSC單細胞生存得更好、遷移能力更強(圖3e, 3f, 3g)。

l 隨機選取CEPT處理后的單克隆，建系傳4代培養后，細胞核型檢測均正常，表明CEPT沒有引起遺傳異常(圖3h)。

l 同時，使用CRISPR/Cas9進行基因組編輯CEPT處理后的hPSC，發現其改善了電穿孔時的細胞存活率(圖3i-3l)。

Cytena單細胞打印機簡化生成 CRISPR 編輯的MSC克隆的工作流程

除了在hPSC的應用外，Cytena單細胞打印機在再生醫學領域中被用于簡化生成 CRISPR 編輯的間充質干細胞（MSC）克隆的工作流程。

圖4： RANKL-KO MSCs工作流程

文獻4向我們展示了一種高效、高通量的工作流程（圖4），該工作流程采用f.sight™單細胞打印機，通過GFP報告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質干細胞(MSC)，以進一步增強MSCs在再生醫學中的治療能力。

圖5：Cytena單細胞打印機利用GFP簡化篩選陽性單克隆MSCs流程

f.sightTM的高靈敏度能夠檢測到編輯后的MSCs的低熒光信號并富集到編輯成功的帶綠色熒光信號的細胞（圖5A）, f.sightTM的單細胞分離效率高達93.9±2.7%（n=451）（圖5A) 。轉染質粒的間充質干細胞（31.3±8%）和未轉染的間充質干細胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，基因編輯過程通常會損害細胞活力，這也表明f.sight單細胞分選過程柔和，因此產生的系統偏差較小（圖5B）。

圖6：RANKL-KO MSCs增強成骨分化能力

CRISPR/Cas9編輯過的敲除RANKL蛋白的間充質干細胞與野生型MSC展現出類似的形態學。在第21天，將細胞固定并用茜素紅染料染色，以觀察通常在骨細胞中表現出的鈣化。鈣化的存在表明RANKL敲除的MSCs仍然保持其成骨特性分化的能力。

最終，獲得182個單克隆細胞，選取17個做進一步驗證，獲得2個成功敲除RANKL基因并表現出增強成骨分化能力的克隆。

參考文獻：

1. De Masi C, Spitalieri P et al. Application of CRISPR/Cas9 to human-induced pluripotent stem cells: from gene editing to drug discovery. Hum Genomics. 2020 Jun 26;14(1):25. doi: 10.1186/s40246-020-00276-2.

2. Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021)

3. Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020)

4. Gross, Tobias, et al. Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and Emulsion Coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning. Plos one 16 3 e0238330 2021.

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Cytena公司潛心研究單細胞打印機技術多年，不斷升級設備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細胞治療、基因治療、干細胞等研究領域的客戶快速搭建單細胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細胞打印機總代理商，為您提供優質的售前售后服務。

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