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HALO液相色譜柱的維護(hù)與保存

閱讀：1378 發(fā)布時(shí)間：2022-9-19

為了最大限度地延長(zhǎng)高效液相色譜柱的使用壽命并確保其最佳性能，有必要對(duì)色譜柱進(jìn)行適當(dāng)?shù)木S護(hù)。許多不同因素可能導(dǎo)致色譜柱分離度和靈敏度降低，但通常情況下，下列因素會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)色譜柱出現(xiàn)性能問(wèn)題。

1、污染物

通常，樣品中含有來(lái)源于樣品基質(zhì)的成分，這些成分可能會(huì)吸附于色譜柱之上。鹽、脂類、增塑劑和聚合物是在分析過(guò)程中可能與固定相接觸的成分。這些成分會(huì)損壞色譜柱和檢測(cè)器，并在分析過(guò)程中出現(xiàn)雜質(zhì)峰。如果這些雜質(zhì)成分不能被流動(dòng)相洗脫，它們就會(huì)吸附在色譜柱上。隨著時(shí)間的推移，分析物會(huì)與這些雜質(zhì)產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致保留時(shí)間改變以及峰拖尾，從而影響分離。此外，這些雜質(zhì)的積累可能會(huì)造成色譜柱堵塞，導(dǎo)致色譜柱壓力升高、泵損壞、并導(dǎo)致色譜柱柱床塌陷，強(qiáng)烈建議使用保護(hù)柱來(lái)避免這類問(wèn)題。保護(hù)柱是用與分析柱相同的填料填充的短柱，安裝在進(jìn)樣器和分析柱之間。使用一段時(shí)間后，需要更換一個(gè)新的保護(hù)柱，以最大限度地延長(zhǎng)分析柱的使用壽命。

2、pH不穩(wěn)定

始終確保色譜柱在pH耐受范圍內(nèi)使用。請(qǐng)查閱色譜柱的使用說(shuō)明書以確認(rèn)該柱的pH范圍。當(dāng)保存色譜柱時(shí)，應(yīng)將色譜柱中的酸性或堿性緩沖鹽清洗干凈。

3、高背壓

面多孔顆粒(SPP)的固定相與粒徑更小的全孔顆粒(FPP)相比，能在更低的背壓下提供更高的分離。藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范的要求是在盡可能低的壓力下運(yùn)行分析方法，以最大限度的延長(zhǎng)儀器和色譜柱的使用壽命。避免壓力沖擊也是很重要的。壓力沖擊是指壓力在短時(shí)間內(nèi)突然增加或減少。他們可能導(dǎo)致色譜柱柱床塌陷，并導(dǎo)致色譜圖峰分叉。

所有2µm產(chǎn)品和1000? 2.7µm內(nèi)徑為2.1mm和3.0mm色譜柱耐壓1000bar。其余規(guī)格的色譜柱耐壓600bar。如下表所示：

毛細(xì)柱

顆粒大小	內(nèi)徑(mm)	耐壓(bar)
所有	0.75和0.1	600
所有	0.2 – 0.5	400

非毛細(xì)柱

顆粒大小	內(nèi)徑(mm)	耐壓(bar)
所有	1.0	600
2μm	2.1, 3.0	1000
2.7µm 1000? (孔徑)	2.1, 3.0	1000
2.7µm	2.1, 3.0, 4.6	600
3.4 µm 400? (孔徑)	2.1, 3.0, 4.6	600
5μm	2.1, 3.0, 4.6	600

注：“所有"表示所有可用的色譜柱規(guī)格型號(hào)

4、流動(dòng)相質(zhì)量差

必須使用高質(zhì)量的溶劑(HPLC或MS級(jí))作為流動(dòng)相，并確保流動(dòng)相的pH值在所使用的色譜柱的耐受pH范圍內(nèi)。請(qǐng)查閱色譜柱使用與維護(hù)指南。質(zhì)量差的溶劑中往往會(huì)含有雜質(zhì)，會(huì)吸附在色譜柱上，從而干擾分離。建議在使用前對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾，在分析過(guò)程中使用保護(hù)柱有助于除去流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)。

5、柱溫過(guò)高

為了最大限度的延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，柱溫不宜超過(guò)色譜柱的最高可耐受溫度。可耐受溫度可以查閱色譜柱使用與維護(hù)指南。

6、平衡時(shí)間不足

色譜柱的平衡時(shí)間取決于色譜柱規(guī)格。一般情況下，一根色譜柱可用20倍柱體積的溶劑平衡。請(qǐng)參照以下方程計(jì)算柱體積：

①色譜柱體積(µL)= (1/4)(內(nèi)徑×2)(π)(柱長(zhǎng))(孔隙體積)

②π = 3.14

③孔隙體積= 0.50(SPP顆粒)

④內(nèi)徑和柱長(zhǎng)以mm為單位

下面給出一個(gè)計(jì)算案例：

尺寸為2.1 x100mm的色譜柱：

(2.1mm)×2 = 4.41mm

色譜柱柱體積計(jì)算：

1/4×4.41×3.14×100×0.50 =173µL =0.17mL

當(dāng)流速為0.4mL/min時(shí)，可以在8.5分鐘內(nèi)達(dá)到20倍柱體積。

關(guān)于色譜柱堵塞、污染和清洗的提示

1、壓力突然增加——所有鍵合相

一個(gè)高的壓力峰值或者明顯的急劇增加的柱壓，通常表明色譜柱被堵塞。為了清除堵塞物，可以嘗試反接色譜柱，不接檢測(cè)器，清洗20倍柱體積以去除色譜柱篩板上的顆粒或者污染物。

——請(qǐng)注意：不建議反沖毛細(xì)柱或2µm HALO色譜柱。

2、色譜柱清洗與再生

吸附累積的雜質(zhì)對(duì)色譜柱是有損壞的，但在某些情況下，這些雜質(zhì)可以被除去。下面將介紹如何能實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

①所有非毛細(xì)柱和粒徑>2µm的色譜柱清洗（每項(xiàng)溶劑沖洗10倍柱體積）

C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl鍵合相

為了從色譜柱上去除強(qiáng)殘留的物質(zhì)，使用非常強(qiáng)的溶劑(如正在使用的流動(dòng)相的100%的有機(jī)成分)反向清洗色譜柱。如果需要使用更強(qiáng)的溶劑清洗，建議使用二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(95/5 v/v)。特殊情況下可能需要使用非常強(qiáng)的溶劑，如DMF或者DMSO。

——請(qǐng)注意：不建議反沖毛細(xì)柱或2µm HALO色譜柱。

②所有顆粒的色譜柱再生（每項(xiàng)溶劑沖洗20倍柱體積）

C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phenyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphenyl和Diphenyl鍵合相

如果前述的清洗程序無(wú)效，可以嘗試使用其他方法再生色譜柱。下面是反相色譜柱(RP)的再生程序。一般來(lái)說(shuō)，再生的過(guò)程是相似的，其共同點(diǎn)是使用的清洗溶劑強(qiáng)度增加，并通常以非極性溶劑結(jié)束。至關(guān)重要的是，所使用的溶劑必須是能夠互溶的。

1) 甲醇

2) 乙腈

3) 50/50 ACN/IPA

4) IPA

5) 二氯甲烷

6) 己烷

7) IPA

8) 重新平衡到初始條件

步驟1-4通常足以清洗大多數(shù)的色譜柱，但是如果這還不夠，可以增加5和6。但是，在使用強(qiáng)非極性溶劑(如己烷)后，在重新平衡到初始溶劑體系之前用IPA清洗過(guò)渡是至關(guān)重要的，因?yàn)樗c己烷不互溶。

HILIC和PENTA-HILIC鍵合相

1、HILIC色譜柱清洗

——請(qǐng)注意：不建議反沖毛細(xì)柱或2µm HALO色譜柱

為了從色譜柱上去除強(qiáng)保留的物質(zhì)，使用50/50甲醇/水等強(qiáng)溶劑反相清洗色譜柱。特殊情況下，可能需要使用非常強(qiáng)的溶劑，如100%的流動(dòng)相中的極性成分。

另外，二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(95/5 v/v)通常非常有效。對(duì)于清洗后的HILIC色譜柱，需要先以70/30 ACN/H2O低流速?zèng)_洗2 – 3小時(shí)。

2、Penta-HILIC色譜柱清洗

為了從色譜柱上去除強(qiáng)保留的物質(zhì)，使用10/90甲醇/水等強(qiáng)溶劑反向清洗色譜柱。特殊情況下，可能需要使用非常強(qiáng)的溶劑，如100%的流動(dòng)相中的極性成分，通常是水。

色譜柱保存(所有鍵合相)

1、長(zhǎng)期保存

長(zhǎng)時(shí)間保存(超過(guò)5天)硅膠基質(zhì)的色譜柱，建議使用100%乙腈。例外的是Biphenyl，它應(yīng)該保存在100%甲醇中。

使用含鹽流動(dòng)相后，一定要用等比例不含鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱除鹽，然后再用至少10倍柱體積的乙腈沖洗保存。

2、短期保存

短時(shí)間保存(低于5天)硅膠基質(zhì)的色譜柱，可將色譜柱保存在大部分常規(guī)使用的流動(dòng)相中。使用含鹽流動(dòng)相后，一定要用等比例不含鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱除鹽，然后再保存。

注意：每根色譜柱在使用之前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀使用說(shuō)明書！

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HALO液相色譜柱的維護(hù)與保存

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