免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。

　　免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片的處理以及細胞的活力，有人根據成功經驗總結出許多有益的細節或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。

　　由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個免疫熒光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。總之，免疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。

　　免疫熒光實驗基本實驗步驟：

　　細胞準備

　　對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

　　固定

　　根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮鈉的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3*5次。

　　通透

　　使用交聯劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3*5min。

　　封閉

　　使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。

　　一抗結合

　　室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

　　二抗結合

　　間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　封片及檢測

　　滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

　　免疫熒光實驗步驟技巧

　　封閉:

　　將組織切片自-20℃冰箱取出，室溫靜置15 min（可采用免疫熒光封閉用筆在組織周圍畫圈以避免抗體擴散），隨后采用1×PBS洗三次，每次5 min，最后采用blocking buffer（綿羊血清5%，0.3%Triton-100，采用1×PBS稀釋可得）室溫封閉1 h。

　　一抗孵育：

　　濾紙吸掉玻片上的封閉液（吸取的時候要注意不要碰到組織樣本），并滴加blocking buffer配置的待測抗體，將玻片置于濕盒中，4℃孵育過夜。既然是濕盒，應該都知道里面要加水防止抗體蒸發的吧，嗯嗯，聰明的你們肯定知道。

　　二抗孵育：

　　第二天把濕盒從冰箱拿出來(一般來說大部分的染色可直接做下面的步驟，如果待測蛋白比較難染色，可將濕盒置于室溫繼續孵育一段時間，時長自己定)，回收一抗(土豪的話就隨意)，1×PBS滴加到玻片上，洗三次，每次3 min，隨后吸取多余的1×PBS。

　　接下來所有的操作均在避光條件下進行，這很重要！

　　滴加二抗（同樣用blocking buffer配置哦），室溫孵育1 h。

　　染核：

　　吸掉二抗，滴加DAPI孵育3-5 min，1×PBS同上方法洗三次。

　　最后用濾紙吸取多余的液體，用含有抗淬滅劑的封片劑封片（有小伙伴用指甲油，也行），避光保存后即可在顯微鏡下觀察染色的情況。