今天我們要介紹幾種特殊的光學(xué)顯微鏡和不同光學(xué)顯微鏡之前的區(qū)別。
摘要
1.暗視野顯微鏡
2.體視顯微鏡
3.熒光顯微鏡
4.相差顯微鏡
5.倒置顯微鏡
6.偏光顯微鏡
1暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡不具備觀察物體內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)的功能，但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和運(yùn)動(dòng)。因而常用于觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等。
暗視野顯微鏡的基本原理是丁達(dá)爾效應(yīng)。當(dāng)一束光線透過(guò)黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”，這種現(xiàn)象即丁達(dá)爾效應(yīng)。
暗視野顯微鏡在普通的光學(xué)顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進(jìn)入物鏡和目鏡，僅散射光能通過(guò)，因而視野是黑暗的。
暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：
1.安裝暗視野聚光器(或用厚實(shí)的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果)。
2.選用強(qiáng)光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進(jìn)入物鏡。
3.在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。
4.進(jìn)行中心調(diào)節(jié)，即水平移動(dòng)聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點(diǎn)(圖1-2中圓錐光束的頂點(diǎn))對(duì)準(zhǔn)待檢物。
5.選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距，按普通顯微鏡的方法操作。
2體視顯微鏡
體視顯微鏡又稱實(shí)體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強(qiáng)、成像清晰寬闊、長(zhǎng)工作距離(通常為110mm)以及連續(xù)放大觀看等特點(diǎn)。生物學(xué)上常用于解剖過(guò)程中的實(shí)時(shí)觀察
奧特光學(xué)SZ680/810體視顯微鏡
普通光學(xué)顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角(一般為12o15o)，因而能形成三維空間的立體圖像。
體視顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于：
1.體視顯微鏡的鏡檢對(duì)象可不必制作成裝片。
2.體視顯微鏡載物臺(tái)直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據(jù)鏡檢的對(duì)象和要求加以選擇。
3.體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。
4.體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數(shù)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)螺旋連續(xù)調(diào)節(jié)。
3熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行定性和定量研究的一種光學(xué)工具。
細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)物質(zhì)有兩類，一類直接經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)熒光，如葉綠素等；另有一些物質(zhì)本身不具這一性質(zhì)，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經(jīng)紫外線照射后亦可發(fā)熒光
正置生物熒光顯微鏡/倒置生物熒光顯微鏡
熒光顯微鏡的原理為利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源(如超高壓汞燈)，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光3650λ或紫藍(lán)光4200λ)作為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各色的熒光后，再通過(guò)物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過(guò)濾，后經(jīng)由目鏡的放大作用加以觀察。
阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。
熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：
1.透射式熒光顯微鏡
較為舊式的熒光顯微鏡，其激發(fā)光源通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標(biāo)本材料。
2.落射式熒光顯微鏡
激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。
光路中需加上一個(gè)雙色束分離器(分色鏡)，它與光軸呈45o角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。
此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。
4相差顯微鏡
相差顯微鏡是能將光通過(guò)物體時(shí)產(chǎn)生的相位差(或光程差)轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?光強(qiáng)度)變化的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標(biāo)本。
人眼只能鑒別可見(jiàn)光的波長(zhǎng)(顏色)和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數(shù)生物標(biāo)本高度透明，光波通過(guò)后振幅基本不變，僅存在相位的變化。
相差顯微鏡基本把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng))，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。
從結(jié)構(gòu)上看，相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同之處在于：
1.環(huán)形光闌具有環(huán)形開(kāi)孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。
2.相位板相差顯微鏡在物鏡內(nèi)部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相板上有兩個(gè)區(qū)域，直射光通過(guò)的部分叫“共軛面”，衍射光通過(guò)的部分叫“補(bǔ)償面”。相位板按工作效果分為兩種類型：
(1)A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加明亮，形成亮反差(或稱負(fù)反差)。
(2)B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加暗淡，形成暗反差(或稱正反差)。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上以“Ph”字樣。
合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡
相差顯微鏡配備有一個(gè)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡(在外殼上標(biāo)有“CT”符號(hào))，用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面*吻合，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)直射光和衍射光的特殊處理。
使用時(shí)撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)節(jié)合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn)，視野中會(huì)呈現(xiàn)兩個(gè)圓環(huán)，分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個(gè)調(diào)節(jié)螺旋，使兩環(huán)*重疊。如明亮的光環(huán)過(guò)小或過(guò)大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)*吻合。如果聚光器已升到高點(diǎn)或降到低點(diǎn)而仍不能矯正，說(shuō)明玻片太厚了，應(yīng)更換。調(diào)好后即可取下合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡。
綠色濾光片
用于調(diào)整光源的波長(zhǎng)。照明光線的波長(zhǎng)不同，會(huì)引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長(zhǎng)范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來(lái)調(diào)整。
相差顯微鏡的使用步驟如下：
①根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。
②將標(biāo)本玻片放到載物臺(tái)上，進(jìn)行光軸中心的調(diào)整。
③使用合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)*重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過(guò)程中，每次更換物鏡倍數(shù)時(shí)，必須重新進(jìn)行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。
④加綠色濾光片，按普通光學(xué)顯微鏡的操作步驟進(jìn)行觀察。
5倒置顯微鏡
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)和普通顯微鏡基本相同，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)位置交換，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，需配制相差物鏡。
奧特光學(xué)BDS500倒置生物顯微鏡
6偏光顯微鏡
偏光顯微鏡可用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如染色體、膠原、纖維絲等。
奧特光學(xué)BK-POL投射偏光顯微鏡
奧特光學(xué)BK-POL透反射偏光顯微鏡
和普通顯微鏡不同的是：
①偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡(起偏器)，使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光。
②鏡筒中有檢偏振鏡(檢偏器，一個(gè)偏振方向與起偏器垂直的的起偏器)。
③使用旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)。當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無(wú)論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過(guò)這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體。
④配備補(bǔ)償器或相位片；
⑤使用無(wú)應(yīng)力物鏡。
