本文要點：本文中，設(shè)計了可改變大小的 NIR-II納米治療劑(BBT-HASS@FPMPL NPs)，以同時增強(qiáng)在深部腫瘤組織中的穿透和滯留，從而實現(xiàn)精確成像和有效的PTT 治療。BBT-HASS@FPMPL NPs表現(xiàn)出 pH 觸發(fā)的電荷逆轉(zhuǎn)行為，腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的大小轉(zhuǎn)換，以及隨后的游離BBTN+釋放的過程通過胞質(zhì)轉(zhuǎn)運進(jìn)入深部腫瘤組織。結(jié)合 BBT-HASS @ FPMPL NPs 的 NIR-II 熒光和光熱特性可實現(xiàn)NIR-II 熒光圖像引導(dǎo)光熱治療，有效抑制皮下腫瘤。由于良好的細(xì)胞攝取、在腫瘤組織中的深度滲透和 NIR-II 熒光圖像的高分辨率，僅注射一劑即可持續(xù) 6 天。作者期望將 NIR-II 熒光的高分辨率與深度腫瘤穿透和長的腫瘤內(nèi)滯留相結(jié)合的這種納米治療平臺可用于實時監(jiān)測腫瘤過程、精確診斷和增強(qiáng)的光療。近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng)

圖1. BBT-HASS@FPMPL納米粒子的合成與表征

使用FTIR光譜分析 FPMPL 的結(jié)構(gòu)，1705cm-1處的峰歸因于 DMMA 的 C–C(圖1a)，表明成功將DMMA綁定到EPL，在 1115cm-1和 2886cm-1 處的 C–O 和 C–H 拉伸振動峰值表明成功引入了 FA-PEG。為了實現(xiàn)電荷反轉(zhuǎn)特性和尺寸減小，BBT-HA NPs被PEG-FA修飾的聚賴氨酸（FPMPL）外殼進(jìn)一步封裝，以產(chǎn)生BBT-HASS @ FPMPL NPs。圖1c表明，酸性條件可以導(dǎo)致BBT-HASS @ FPMPL NPs的電荷反轉(zhuǎn)。圖1e顯示，在pH 6.5下用GSH和透明質(zhì)酸酶（Hyal）同時處理后，BBTN+能夠從BBT-HASS @ FPMPL NPs釋放。這揭示了在 pH 6.5 時，通過Hyal和 GSH 共同作用，有利于BBTN+在腫瘤深部組織的有效滲透和滯留。

圖2. BBT-HASS@FPMPL NPs的光物理性質(zhì)和光熱性能

如圖2a所示，BBT-HASS@FPMPL NPs顯示出從 600 -1000 nm的強(qiáng)而寬的吸收帶，這可以歸因于BBTN+片段；并且在約 1101 nm 處也顯示出強(qiáng)烈的 NIR-II 發(fā)射帶，這表明是一種潛在的 NIR-II 成像劑。BBT-HASS@FPMPL 的升溫與濃度和激光功率密度呈正相關(guān)，進(jìn)一步計算出BBT-HASS @ FPMPL NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率為 20.4 %(圖2e)。經(jīng)過 5 次激光輻照加熱/冷卻循環(huán)后，溫度仍可達(dá)到與原始納米粒子相同的水平(圖2f)，顯示出BBT-HASS@FPMPL的良好的光熱穩(wěn)定性和在光熱治療上的巨大潛力。

圖3. 通過三維4T1 細(xì)胞球體模型對BBT-HASS@FPMPL NPs進(jìn)行體外滲透評估

圖4. BBT-HASS @ FPMPL NPs在 4T1 腫瘤細(xì)胞中的特異性滯留增強(qiáng)

圖3 表明BBT-HASS @ FPMPL NPs能有效進(jìn)入4T1細(xì)胞，并且加入胞吞抑制劑NaN3 后，熒光強(qiáng)度顯著降低，而胞吐抑制劑vacuolin-1 處理的細(xì)胞熒光更強(qiáng)(圖3a，b)。圖3c-e表明在 pH 6.5 時發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)并且FPMPL外殼的pH依賴性陽離子化和脫離可以促進(jìn)腫瘤穿透。這一發(fā)現(xiàn)揭示了BBT-HASS@FPMPL NPs在酸性條件下的滲透能力可能是由跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運引起的。

圖4 表示BBT-HASS@ FPMPL NPs的 HA/FA 雙靶向能力有利于細(xì)胞攝取。并且經(jīng)過引入 HA 和二硫鍵后，游離BBTN+可從BBT-HASS@FPMPL NPs釋放并與腫瘤微環(huán)境中硫醇和 Hyal反應(yīng)，以延長滯留時間。BBTN+信號隨著孵育時間的推移而逐漸增加，與初始強(qiáng)度相比，第2天BBTN+的平均熒光強(qiáng)度增加了10.3倍。綜上所述，這些現(xiàn)象表明BBT- HASS@FPMPL NPs可能是一種用于腫瘤長期成像的特異性 NIR-II 探針。

圖5. BBT-HASS@FPMPL NPs的體外細(xì)胞毒性分析

通過 MTT 法評估BBT-HASS @ FPMPL NPs的增強(qiáng)光熱治療效果，并用中性共軛BBT NPs與BBT-HASS @ FPMPL NPs進(jìn)行比較。如圖5、b所示，4T1 細(xì)胞在激光照射下用BBT-HASS @ FPMPL NPs處理時，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而逐漸降低。圖5c通過 Calcein-AM/PI 染色進(jìn)一步驗證了BBT-HASS @ FPmpl NPs增強(qiáng)的 PTT 療效。圖5d使用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI 凋亡試劑盒，通過流式細(xì)胞儀分析評價細(xì)胞凋亡情況。本發(fā)現(xiàn)揭示了BBT- HASS@FPMPL NPs能夠顯著提高 PTT 療效。

圖6. 在荷瘤小鼠中通過BBT-HASS@FPMPL NPs進(jìn)行體內(nèi) NIR-II 熒光成像和實時腫瘤監(jiān)測

考慮到BBT-HASS @ FPMPL NPs具有良好的NIR-II 熒光發(fā)射，于是在4T1腫瘤小鼠中檢測了它們的 NIR-II 成像性能。圖6a-d表明，由于BBT-HASS@FPMPL NPs具有良好的NIR-II光學(xué)空間分辨率和對比度，可改善體內(nèi)圖像。如圖6e所示，BBT- HASS@FPMPL NPs可主動靶向腫瘤組織，注射BBT-HASS@FPMPL NPs僅 2 h，在腫瘤部位即可檢測到明顯的NIR-II 熒光信號。BBT-HASS @ FPMPL NPs在腫瘤區(qū)域的熒光強(qiáng)度在 24 h內(nèi)逐漸增強(qiáng)(圖6f)，12 h 時信噪比達(dá)到峰值 7(圖6g)。結(jié)果證明BBT-HASS@FPMPL NPs可作為高效的 NIR-II 探針，用于實時可視化腫瘤過程，并可精確測量腫瘤的真實大小。

圖7. 體內(nèi) PTT 療效及組織學(xué)分析

在 4T1 荷瘤裸鼠中研究了BBT-HASS @ FPMPL NPs的體內(nèi)光熱效應(yīng)和抗腫瘤效應(yīng)。隨著激光照射時間的延長，PBS 組的腫瘤溫度幾乎保持相同，而激光照射下BBT-HASS@FPMPL NPs組腫瘤溫度迅速升高至 53.2 ℃。且激光照射下接受BBT-HASS @ FPMPL NPs治療的小鼠，其瘤體生長明顯受到抑制，說明BBT-HASS @ FPMPL NPs具有良好的光熱特性和抗癌功效。圖7g顯示小鼠體重在實驗過程中沒有明顯波動，表明BBT-HASS @ FPMPL NPs沒有明顯的系統(tǒng)毒性。H&E、TUNEL、Ki67染色均證實了BBT-HASS @ FPMPL NPs的良好 PTT 療效。通過血液學(xué)和血液生化分析，BBT-HASS@FPMPL NPs組的血液學(xué)指標(biāo)與 PBS 組和對照組相比幾乎沒有差異，表明無肝和腎毒性。

參考文獻(xiàn)

Su, P.; Sun, W.; Wang, G.; Xu, H.; Bao, B.; Wang, L., Size transformable organic nanotheranostic agents for NIR-II imaging-guided oncotherapy. Journal of Colloid and Interface Science 2024, 654, 740-752.