本文要點：近紅外二區（NIR-Ⅱ）窗口的熒光生物成像可以提供具有低背景信號的精確圖像。根據單體的固有發射，實現有機熒光團的吸收/發射波長超過1300 nm是具有挑戰性的工作。減少聚集熒光淬滅（ACQ）效應是在理想區域實現熒光生物成像的有效策略。本文報道了兩個在相同骨架上具有不同側鏈的NIR-Ⅱ氧雜蒽熒光團（CM1和CM2），及其相應的組件CM1 NPs和CM2 NPs。其中CM2 NPs顯示出ACQ效應的顯著降低，zui大吸收/發射波長拓展至1235/1250 nm。CM2 NPs可以高分辨率區分鄰近的動脈與靜脈，并且可以實現超過1300 nm的血管造影，分辨小至0.23 mm的毛細血管。近紅外二區小動物活體成像系統 - MARS

Figure 1

作者首先完成了CM1和CM2分子的制備及表征。通過將兩個氧雜蒽核與花青染料橋聯得到NIR-Ⅱ氧雜蒽染料核心CL1，隨后CL1與硫醇進行經典親核取代反應合成CM1和CM2（CM1 : 3,5 -雙（三氟甲基）苯硫醇；CM2 ：2- （4-巰基對苯基）乙酸）（Figure 2a）。隨后對其光物理性質進行了考察。CM1和CM2在NIR-Ⅱ區域都表現出較長的吸收/發射波長，在氯仿中的zui大吸收/發射波長分別為1180/1220 nm和1160/1200 nm；CM1和CM2的摩爾吸光系數分別約為26800和31300 M-1cm-1，計算出CM1和CM2的熒光量子產率為0.70 × 10-4和0.76 × 10-4（Figure 2b和Table 1）。作者還以市售的吲哚菁綠（ICG）和IR 1061染料為參考，對CM1 NPs和CM2 NPs的光穩定性進行了探索，由于分子剛性更大，CM1和CM2在1064 nm照射下的光穩定性與IR 1061相當，而ICG在808 nm的光照射下迅速漂白（Figure 2c）。

Figure 2

Table 1

作者接著完成了CM1 NPs 和CM2 NPs的制備并對其表征。采用兩親聚合物F127包封CM1和CM2賦予染料用于靜脈注射的親水性，采用經典乳化方法制備兩種水分散的納米顆粒CM1 NPs 和CM2 NPs（Figure 3a）。由透射電子顯微鏡（TEM）圖像得到其平均納米顆粒尺寸為50和30 nm，由動態光散射（DLS）得到其流體動力學尺寸為126和100 nm（Figure 3b和c），流體動力學尺寸略大于TEM中的顆粒尺寸來源于水化層的包裹。此外，CM1 NPs 和CM2 NPs在Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）和胎牛血清（FBS）中表現出良好的穩定性。作者進一步檢查它們的吸收和發射光譜發現，CM1 NPs表現出典型的H-聚集現象，zui大吸收波長為790 nm（Figure 3d），猜測CM1 NPs的弱熒光強度來源于由H-聚集體導致的ACQ效應，與之相反，由于ACQ效應的顯著降低，CM2 NPs比CM1 NPs表現出更高的熒光強度，zui大吸收波長為1235/1250 nm（Figure 3e）。作者計算出，分散在水中的CM1 NPs和CM2 NPs的熒光量子產率分別為0.01 × 10-4和0.15 × 10-4。通過體外NIR-Ⅱ熒光成像，作者發現CM2 NPs通過1150和1300長通（LP）過濾器表現出明顯的熒光信號，而CM1 NPs則幾乎沒有熒光信號。此外，CM2 NPs在pH 4-9范圍內表現出良好的pH穩定性。由此可見，CM2 NPs可用于1300 nm以上的NIR-Ⅱ熒光成像。

Figure 3

作者接著對CM2 NPs減少ACQ效應的機制進行探究。首先借助MD模擬來幫助理解分子間堆疊方式降低ACQ效應的機制（Figure 4a），如Figure 4b（側視圖）和4c（頂視圖）所示，CM2表現出高度扭曲的行為，避免了形成具有龐大平面結構的H-聚集體。將CM2分成三個部分來測量兩個相鄰分子的分子間距離，如Figure 4b所示，CM2的巰基部分命名為1，兩點的氧雜蒽核分別命名為2和3，相鄰分子的相應三個部分分別命名為1’、2’和3’。如Figure 4d所示，兩個相鄰的CM2分子的羧基在2.8 ?的距離處形成氫鍵。兩個相鄰分子的秋季垂直距離為3.5 ?，滑動角為46.8°。兩個相鄰CM2分子的氧雜蒽核2與2’間的垂直距離為4.0 ?，滑動角為46.7°，表現為π-π折疊行為（Figure 4e）。值得注意的是，這兩個部分的滑動角幾乎相等，均小于J-聚集體的臨界值54.7°。而如Figure 4f所示，兩個相鄰CM2分子的氧雜蒽核3與3’之間的垂直距離為3.7 ?，呈邊對面堆疊方式。這種典型的CH-π相互作用有助于形成更穩定的組裝體并延長體內循環。作者由此提出，側鏈工程驅動的氫鍵、π-π相互作用及CH-π相互作用降低了CM2的ACQ效應。

作為比較，作者還通過MD模擬探索了CM1 NPs的分子間堆疊方式，證實了CM1的H-聚集行為，解釋了CM1 NPs表現出顯著的ACQ效應的原因。

Figure 4

作者繼續考察了CM1 NPs和CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影性能。將CM1 NPs或CM2 NPs（100 μl， 1 mg/ml）靜脈注射到小鼠體內進行后肢血管造影。作者采用1150 LP濾光片截止小于1150 nm的發射，從而盡可能長時間地探索它們在NIR-Ⅱ的成像能力。如Figure 5a所示，CM2 NPs的高熒光強度使得在使用1150 LP的濾光片情況下，仍可以區分明亮精確的血管。而靜脈注射CM1 NPs后則沒有觀察到明顯的血管。在Figure 5a中標記橫截面線1和2，通過高斯擬合曲線，可得截面線（1）處的血管半峰全寬（FWHM）分別為0.40、0.38和0.37（Figure 5b），而截面線（2）處的血管FWEM分別為0.47、0.50和0.28（Figure 5c）。由此可見，CM2 NPs的高分辨率成像足以成功區分鄰近的動脈和靜脈，表明了其更好的NIR-Ⅱ血管造影性能。此外，CM1 NPs和CM2 NPs均通過肝膽系統代謝出體外。

隨后作者研究了商業染料ICG及IR 1061的血管成像能力，以進行對比。由于808 nm激光的穿透深度及ICG在NIR-Ⅱ窗口的低亮度，靜脈注射ICG后無法清楚區分后肢脈管系統（Figure 5d）。與之類似，由于嚴重的熒光淬滅效應，IR 1061在980 nm或1064 nm激發下靜脈注射后幾乎無熒光信號被收集到。

Figure 5

作者zui后探索了CM2 NPs超過1300 nm的NIR-Ⅱ血管造影性能。由于CM2 NPs在800 – 1400 nm的范圍內顯示出寬吸收波長，作者首先在808、980和1064 nm處分別探索了CM2 NPs在不同波長激發下的血管成像能力。如Figure 6a所示，采用1150 LP濾波器，CM2 NPs在1064 nm波長激發下的血管圖像比在808和980 nm波長激發下更亮。且在1064 nm波長的高亮度下，可用0.39和0.41 mm的FWEM區分鄰近的動脈與靜脈（Figure 6b）。但無法在808和980 nm波長激發下的血管圖像識別鄰近的動脈與靜脈（Figure 6b）。

作者進一步將CM2 NPs應用于1064 nm激發下超過1300 nm的血管造影。如Figure 6c所示，采用1300 LP的濾光片的血管成像具有比1150 LP濾光片更低的背景信號。橫截面線（6）處血管的FWEM分別為0.63和0.52 mm，信號背景比（SBR）為1.27，橫截面線（7）處血管的FWEM分別為0.58和0.48 mm，SBR為1.33（Figure 6d）。更出色的是，橫截面線（8）處的血管FWEM分別為0.33和0.23 mm，SBR為1.14（Figure 6d），表明1300 LP濾光片的血管成像可以實現毛細血管的區分。由此可知，CM2 NPs能以高分辨率實現對超過1300 nm的血管成像。

得益于1300 nm的高分辨成像，可通過使用超過1300 nm的成像平臺區分不同類型的血管。CM2 NPs的熒光光譜中超過1300 nm的更多發射部分可有效應用于血管成像。而CM1 NPs只有很小的尾峰發射部分可以達到1300 nm，這對于1300 nm以上的高效成像是不夠的。作者隨即考察了CM2 NPs在小鼠體內的毒性，以健康小鼠為對照。血常規指標、血清生化指標以及主要器官的H&E染色圖像的結果顯示，CM2 NPs可用作安全的熒光體內顯像劑。

Figure 6

總結：作者合成了兩種帶有不同側鏈的氧雜蒽染料（CM1和CM2），它們表現出NIR-Ⅱ激發特征、相似的光物理性質和良好的穩定性。通過將染料包封在F127中制備相應的納米粒子，CM2 NPs顯著克服了ACQ效應而CM1 NPs沒有，且CM2 NPs表現出高亮度的高效NIR-Ⅱ發射。作者提出減少CM2的ACQ效應的機制為多重相互作用即分子間氫鍵、π-π相互作用和CH-π相互作用。CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影顯示出高亮度與對比度。與NIR-Ⅰ在808 或980 nm激發下相比，CM2 NPs在1064 nm的NIR-Ⅱ激發下的圖像具有更高的分辨率，可以區分鄰近的動脈和靜脈。此外，CM2 NPs能夠以低背景信號實現超過1300 nm的血管造影，甚至可以分辨小至0.23 mm的毛細血管。CM2 NPs同時滿足體內熒光團的必需條件，對小鼠具有良好的生物安全性。這種由側鏈工程驅動的具有降低ACQ效應的新型NIR-Ⅱ氧雜蒽染料極大地拓展了未來NIR-Ⅱ高分辨率生物成像的臨床應用。

參考文獻

doi.org/10.1016/j.bios.2022.114701

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近紅外二區小動物活體熒光成像系統 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

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多模態系統 - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區高分辨顯微系統，兼容成像型光譜儀

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