順烏頭酸酶(ACO)活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）產(chǎn)品貨號：BA1882產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣產(chǎn)品簡介：順烏頭酸酶(aconitase)，三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸陧槥躅^酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。產(chǎn)品組成：試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；試劑三：1mL×1支，-20℃保存；試劑四：液體60mL×1瓶，4℃保存；試劑五：液體5mL×1瓶，4℃保存；試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加3mL蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用試劑七：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加36mL試劑四充分溶解；工作液：臨用前在36mL試劑七中加入3mL蒸餾水、3mL試劑四、3mL試劑五、3mL試劑六充分混勻。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。樣本的前處理：組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。2. 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)600g，4℃離心5min。3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。5. 在步驟④的沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎(冰浴，功率20%或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次)，用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。測定步驟：1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2. 樣本測定(1)將工作液，置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20℃保存，一星期內(nèi)可用。(2)在1mL石英比色皿中加入100μL樣本900μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。ACO活性計算：1. 用石英比色皿測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=536×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=108×ΔA÷W(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.722×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應(yīng)時間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。