順烏頭酸酶(ACO)活性檢測(cè)試劑盒(微量法)產(chǎn)品貨號(hào)：BA1881產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣產(chǎn)品簡(jiǎn)介：順烏頭酸酶(aconitase)，三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸陧槥躅^酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)品組成：試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；試劑五：液體5mL×1瓶，4℃保存；試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加1.5mL蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用試劑七：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加12mL試劑四充分溶解；工作液：臨用前在12mL試劑七中加入1mL蒸餾水、1mL試劑四、1mL試劑五、1mL試劑六充分混勻。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。樣本的前處理：1. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：2. 稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。3. 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)600g，4℃離心5min。4. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。5. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。6. 在步驟④的沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎(冰浴，功率20%或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次)，用于線粒體順烏頭酸酶活性測(cè)定。測(cè)定步驟：1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。2. 樣本測(cè)定(1)將工作液，置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20℃保存，一星期內(nèi)可用。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL樣本160μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。ACO活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=268×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=54×ΔA÷W(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.108×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=536×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘生成 1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=108×ΔA÷W(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.216×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，0.202mL； T：反應(yīng)時(shí)間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。