α-淀粉酶活性檢測試劑盒（微量法）

產品貨號：BA1012

產品規格：100管/48樣

產品簡介：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質，在540nm有吸收峰；通過測定540nm吸光度增加速率，計算淀粉酶活性。α-AL耐熱，但是β-淀粉酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經過70℃鈍化15min，就只有α-AL能夠催化淀粉水解。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測。  

產品內容：

溶液的配制：

1. 試劑一：若有黃色晶體析出，需加熱溶解后再用；

2. 試劑二：臨用前加入10mL蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解；

3. 標準品：10mg無水葡萄糖。臨用前加1mL蒸餾水，配成10mg/mL葡萄糖標準液。

需自備的儀器和用品：

酶標儀或可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻） 

稱取約0.1g樣本，加0.8mL蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；6000g，室溫離心10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10mL，搖勻，即為淀粉酶原液。

二、測定步驟

1. 分光光度計預熱30min以上，調節波長到540nm，蒸餾水調零。

2. 將葡萄糖標準液用蒸餾水稀釋為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL的標準溶液。

3. 取250μL樣本沸水浴5min作為對照管使用。

4. 按照操作表依次加入各個試劑：

混勻，沸水浴10min，取200μL至96孔板或微量比色皿中，540nm處讀取對照管、測定管、標準管、空白管的吸光度，分別記為A對照、A測定、A標準和A空白，計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。

三、α-淀粉酶活性計算 

1、 標準曲線的繪制：  

以ΔA標準為y軸，以標準溶液濃度為x軸，繪制標準曲線，得到方程y=kx+b。將ΔA測定帶入方程得到x （mg/mL）。

2、 α-淀粉酶活性的計算：

（1）按照樣本質量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產生1mg還原糖定義為1個酶活力單位。

α-淀粉酶活性(U/g質量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2×x÷W

（2）按照蛋白質濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1m 還原糖定義為1個酶活性單位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V樣：加入反應體系中樣本體積，0.075mL；V樣總：提取液總體積，10mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min。

注意事項：

測定的吸光值大于1.5時，可以對樣本進行適當稀釋后測定。若吸光值過小，可以濃縮淀粉酶稀釋液或者淀粉酶原液。