羧酸酯酶（CarE）活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1282

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

哺乳動物CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物。CarE參與脂質(zhì)運輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，有機磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE活性。

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固藍顯色；在450nm光吸收增加速率，計算CarE活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。用前用20mL無水乙醇充分溶解.

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。用前將全部試劑三倒入試劑二瓶中充分溶解。 

試劑三：液體30mL×1瓶，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；然后15000rpm，4℃，離心30min，取上清置于冰上待檢。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。15000rpm，4℃，離心30min，取上清置于冰上待檢。

血清：直接測量。

二、測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二和試劑一置于37℃水浴中預(yù)熱30min以上。

3、在1mL玻璃比色皿中進行如下操作：

迅速混勻后，測定第10s的吸光值記為A1空和A1測，反應(yīng)3min，吹打混勻后立即測定190s的吸光值，記為A2空，A2測。注意：空白管只需做1~2次。計算△A空白管=A2空-A1空，△A測定管=A2測-A1測。

CarE 活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃下，每mL反應(yīng)體系每mg組織蛋白每分鐘催化吸光值增加 1 定義為一個酶活力單位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管)×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 21.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：37℃下，每mL反應(yīng)體系每g組織鮮重每分鐘催化吸光值增加1定義為一個酶活力單位。

CarE 酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷（W÷V樣總×V 樣）÷T

=21.67×(△A測定管-△A空白管)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：37℃下，每mL反應(yīng)體系每1萬個細菌或細胞每分鐘催化吸光值增加1定義為一個酶活力單位。

CarE 酶活(U/10 ⁴cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷（200÷V細胞樣總×V樣）÷T

=0.044×(△A測定管-△A空白管)

（4）按血清計算：

單位的定義：37℃下，每mL反應(yīng)體系每mL血清每分鐘催化吸光值增加1定義為一個酶活力單位。

CarE 酶活(U/mL)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總 ÷V血清÷T

=21.67×(△A測定管-△A空白管)。

V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.015 ml；T：反應(yīng)時間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；200：細菌或細胞總數(shù)，200萬；V 細胞樣總：細胞中加入的試劑一體積，0.4mL；V血清：加入血清體積，0.4mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.975mL。

注意事項:

1、動物組織樣品一般稀釋10倍進行操作測定。

2、當吸光值大于1時，建議將樣品稀釋后測量。計算公式注意乘以稀釋倍數(shù)。

3、建議反應(yīng)時保持37℃的環(huán)境，逐一比色，不建議用96孔板同時測很多樣品。