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新型光散射抑制機制助力高保真光固化生物3D打印

閱讀：742 發布時間：2023-6-1

光固化生物3D打印技術（如：數字光處理，DLP）可精確控制細胞和生物材料在空間中的分布，以此構建復雜幾何結構，被廣泛應用于組織工程、藥物篩選、外科植入物等生物醫學研究領域。然而，在DLP打印過程中，光在固液兩相界面會產生物理散射，細胞的混入會加劇此種散射效應，導致水凝膠在非目標區域固化，降低了打印精度，使眾多生物性能優異且具有小尺度特征（如血管網絡和薄壁結構等）的復雜結構難以成型，限制了DLP打印技術在生物醫學領域的應用。針對這一挑戰，湖南大學機械與運載工程學院韓曉筱教授等提出了一種光吸收與自由基反應協同作用的光散射抑制新機制，并基于此機制開發了一種新型光抑制劑（Curcumin-Na，Cur-Na），降低了載細胞水凝膠光固化打印過程中的光散射效應，將打印精度提高到1.2-2.1像素點，幾何誤差低于5%，成功制造了各種具有多尺度通道和薄壁網絡結構的生物活性功能支架。此外，該方法具有較寬的打印參數窗口，極大地縮短了參數優化過程。相關研究成果以題為"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章發表在《Nature Communications》（SCI一區，Top期刊，IF=17.69）。湖南大學博士研究生賀寧為第一作者，湖南大學機械與運載工程學院韓曉筱教授和陳鋒副教授為通訊作者。

水凝膠生物墨水中傳統的光吸收劑能夠吸收過量的光能量，防止打印層厚過厚，從而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度。然而，傳統的光吸收劑難以解決由光散射引起的水平方向上過固化的問題。因此，該研究提出了光吸收與自由基反應協同作用的光抑制機制：保留傳統光吸收劑功能的同時并能“搶奪"水平方向上散射光激發的自由基，抑制散射區域的自由基與水凝膠發生聚合反應，防止非目標區域的固化，從而提高水平方向上的打印精度和保真度。基于此機制，該團隊首先成功開發了一種新型光抑制劑（Cur-Na）（如圖1），其具有良好水溶性和生物相容性。接著，該團隊制備了含不同光抑制劑的PEG-GelMA生物墨水，通過研究生物墨水的物化性質評價了其可打印性和機械性能（如圖2）。然后通過理論和實驗研究聚合過程，揭示了Cur-Na減輕散射效應的機制（如圖3）：Cur-Na的吸收峰位于425nm附近，非常接近光源波長，可以作為典型的光吸收劑降低光穿透深度。同時，Cur-Na 可以通過更高的反應速率競爭性地搶奪自由基來阻止水凝膠單體聚合形成固化水凝膠。再者，Cur-Na 的反應產物為液體，避免了非目標區域的固化。由于 Cur-Na 的高反應性速率，固定濃度的 Cur-Na 可以在很寬的光強度范圍內抑制散射效應，避免在打印不同結構的時，打印參數再次優化，提高打印效率。文章中，圖4和圖5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和圖案保真度，以驗證Cur-Na在解決光散射效應方面的有效性。之后，團隊將添加了Cur-Na的生物墨水應用到摩方精密 microArch S140光固化打印機中，成功地制造了各種復雜結構體（仿生支架，可灌注血管網絡，極小三周期曲面等），證明了該光抑制劑在制造具有小尺度特征的功能性載細胞三維支架方面的卓。越能力（如圖6）。圖7進一步證明了此生物墨水在組織工程中的適用性。

圖1. 姜黃鈉的合成。a. 用姜黃素和碳酸氫鈉合成姜黃素鈉（Cur-Na）的過程。姜黃素分子中酚羥基的H⁺被Na⁺取代（紅色橢圓），而姜黃素中的羰基鍵發生酮-烯醇互變異構（藍色橢圓）。b. 姜黃素和Cur-Na的¹H-NMR光譜，顯示了合成過程中發生的化學性質的代表性變化。藍色陰影區域表示酚羥基的特征共振（δ=9.65ppm）。綠色陰影是烯烴信號（δ=5.93ppm），表明C=C雙鍵的形成。

圖2. 生物墨水的物化性質。添加了不同濃度光抑制劑的生物墨水（PEG-GelMA/LAP）的儲能模量（G'反映材料的剛度）和損失模量（G''反映材料粘度）隨時間的變化：a.檸檬黃和b. Cur-Na。G'和G'之間的交叉點被稱為凝膠點，而凝膠時間被定義為曝光開始至凝膠點的時間（在該研究中約為20秒）。生物墨水在405nm、13mW cm^?2的光照下曝光30s。陰影區域表示曝光時間。c. 水凝膠的應力-應變曲線。d. 三種水凝膠在~20%應變下的彈性模量。三種生物墨水的e. 溶脹比和f. 溶膠分數對比。

圖3. Cur-Na抑制散射效應的機制。a. 示意圖顯示了當光穿透生物墨水時光強的高斯分布以及不同情況下產生的固化區域，包括無散射、有散射、與細胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水。C_d和C_w分別是固化深度和固化寬度。E₀表示生物墨水表面的光強度，而E_C是引發聚合所需的臨界能量。b. Cur-Na自由基鏈生長聚合的動力學過程由三個階段控制：（1）引發、（2）鏈傳播、（3）（4）終止。k_i，k_p，k_tc和k_td分別是四種反應中的速率常數。每個Cur-Na與三個自由基（R^·）反應，引發聚合物鏈生長，形成單體（M）。激活后的單體可以與其他單體反應，聚合物鏈通過傳播而增長，形成Mn^·和Mm^·。當鏈傳播通過終止反應終止時，形成聚合物（Mn和Mm）。c. Cur-Na和PEGDA聚合過程中官能團的轉化率與時間的關系。散射區域的自由基可以被Cur-Na快速消耗；水凝膠單體由于缺乏自由基而難以在散射區域形成聚合物。

圖4. 水平方向打印精度分析。a. 輻條狀圖案用于評估打印精度，從中心到外圍相鄰輻條之間的間隙增加。打印精度被定義為模糊區域直徑（紅色虛線圓圈）與輻條狀圖案直徑的比值。b. 載細胞結構的熒光染色圖。c. 打印結構的顯微圖像，顯示了純PEG-GelMA生物墨水（上）和添加了檸檬黃（中）和Cur-Na的生物墨水（下）的模糊區域（紅色虛線圓圈）大小與相對曝光能量的關系。E_r指相對能量，定義為實際光能與單位曝光量的比。d. 模糊區域大小與曝光能量的定量關系。e. Cur-Na的高精度打印窗口，灰色、紅色、藍色區域分別代表含1mM、2mM、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口寬度。f. 載細胞打印結構的模糊區域大小與曝光能量之間的定量關系。

圖5. 多層打印中的中空通道打印性分析與評定高保真度的打印誤差分析。a. 具有不同直徑（D=300、500和700μm）通道的圓柱體的3D CAD設計。H表示圓柱體的高度，而h1、h2和h3是通道的中空部分。打印精度定義為中空部分與通道總長度之間的比率。b. 連續層打印中的散射效應及其引起的過固化現象。c-e. 打印精度隨圓柱體直徑的高度和通道直徑的關系。f. 具有不同直徑的多通道結構CAD設計。g. 分別使用含Cur-Na和檸檬黃的生物墨水打印的樣品。h. 通道的實際直徑與設計直徑間的差異。

圖6. Cur-Na在打印生物醫學應用中常用的復雜三維結構時的分辨率和高保真度。a. 脊髓支架。它的結構特點呈現不規則的通道和薄壁網絡，模仿脊髓的內部結構。使用兩種類型的水凝膠成功地制備了支架：PEG-GelMA（10%）和甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的絲素蛋白（Sil-MA（15%））。b. 具有多個分支、可灌注通道（200-800μm）和薄壁（~100μm）的血管網絡。通過注射有色染料溶液進行灌注。c. 具有獨。特拓撲特征（曲面、高孔隙率和連通性）的gyroid支架。d. 打印載HepG2細胞的gyroid支架并培養14天，展現了良好的細胞增殖效果。

圖7. 基于PC-12細胞體外培養的Cur-Na 細胞相容性評價。a. 細胞活死染色熒光圖展示了細胞14天的活力（綠色：活細胞；紅色：死細胞）。b. CCK-8測定細胞增殖情況。細胞在支架中增殖14天，PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠中的細胞展現出最。。好的增殖效果。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠制造的通道支架（直徑200μm）的熒光圖像顯示了均勻的細胞分布。最后一張圖像顯示了細胞沿著通道的生長情況。d. 第1、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦圖像。e. 熒光圖像顯示種植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12細胞的分化和突起形成（第7天）。Tuj-1：Beta3-微管蛋白；DAPI：4’，6-二胺基-2苯基吲哚。

結論

該研究提出了一種光吸收和自由基反應協同作用的光抑制新機制，有效抑制光輔助3D打印中的光散射效應。基于此機制，開發了一種新的光抑制劑（Cur-Na），具有以下獨。特優勢：（1）顯著提高打印分辨率和保真度：在限制水凝膠的溶脹下，打印精度可接近打印機理論極限（~1像素）；（2）具有良好打印參數適應性，極大簡化了打印參數優化過程；（3）在制造具有微尺度通道和薄壁等復雜支架結構上展現出卓。越能力，對于支架內營養物質的運輸和氧氣的滲透具有重要意義；（4）能成功制造對光散射效應尤其敏感的載細胞Gyroid支架，且在歷經14天的培養后，支架內細胞展現出良好的增殖態勢。（5）此方法可應用于其他由自由基鏈生長聚合控制的可光固化墨水中（例如Sil-MA等）。該研究提供的將多尺度特征直接賦予組織結構的方法，對于更好地模擬天然組織微環境至關重要。研究中確立的策略提高了生物3D打印高保真復雜結構的可打印性和可操作性，從而助力更*的組織工程和再生醫學應用的實現。

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新型光散射抑制機制助力高保真光固化生物3D打印

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