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TRIZOL是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑,在樣品裂解或勻漿過程中,TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相,用異丙醇可沉淀回收RNA。
0.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質變性劑,可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失,導致細胞結構降解,核蛋白迅速與核酸分離。 β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。
Trizol試劑可以快速提取人、動物、植物、細菌不同組織的總RNA,該方法對少量的組織(50-100 mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細胞(>107)均有較好的分離效果 。
TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。并且利用DNA、RNA和蛋白質在不同溶液中的溶解性質,可以通過分層分別將不同層中的RNA(上層)、DNA(中層)、蛋白質(下層) 分離純化出來,效率較好。
Trizol試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶,(mRNA和hnRNA成分)兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA,5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值≥1.8。
Trizol試劑使用方法:
該法從細胞中提取RNA--用勻漿器將組織磨碎,加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿,以每分鐘12000轉離心5分鐘,樣品即分成水樣層、中間層和有機層。
※RNA存在于水樣層中,收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。
※在除去水樣層后,中間層中的DNA和蛋白質也能相繼以沉淀的方式還原:乙醇能使中間層的DNA沉淀析出,在中間層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質。
每100ml TRIzol可以抽提100個六孔板中的樣品或100個50-80mg的組織樣品。無論樣品是人、動物、植物還是細菌組織,該方法對少量的組織(50-100mg)和細胞(約五百萬個)及大量的組織(≥1g)和細胞(超過一千萬個)均有較好的分離效果。
每一百萬細胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA,每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA(產(chǎn)量因細胞和組織不同而異)。
TRIzol操作上的簡便性允許其同時處理多個樣品,所有的操作可以在一小時內完成。
TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質的污染,故而能夠作RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和單分子克隆(PCR)。
※如果是用于PCR,當兩條引物位于單一外顯子內時,建議用級聯(lián)擴大的DNase I(Cat. No. 18068)來處理抽提的總RNA。
※TRIzol試劑能促進不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7kb和15kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分),兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時,其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時宜-70℃沉淀過夜。
TRIzol對人體有害,使用時應戴一次性手套,注意防止濺出。
⒈樣品的制備 當樣品富含蛋白質,脂肪,多糖或是細胞外物質例如肌肉,脂肪組織和植物的塊莖部分時可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2-8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘,移除勻漿中不溶解的物質,余下的沉淀中包含有細胞外膜,多糖,以及高分子量DNA,而上層的超浮游物含有RNA。在來自于脂肪組織的樣品中,大量的脂肪漂在最上層因而應該除掉。在每一個個案中,將清亮的勻漿溶液轉移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進行下述的分離步驟。
⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15-30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2-3分鐘。在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。
⒊ RNA的沉淀 將水樣層轉移到一干凈的試管中,如果希望分離DNA和蛋白,有機層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時的每1 ml TRIZOL對應0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15-30°C條件下孵育10分鐘并在2-8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見,形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。
4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次,每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2-8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。
⒌ RNA的再溶解 在操作的最后,簡單干燥RNA沉淀(空氣干燥或真空干燥5-10分鐘)不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是,不能讓RNA沉淀干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA,并在55-60°C下孵育10分鐘(當RNA以后要用于酶切反應時,避免使用SDS。)RNA還能被100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在–70°C。
RNA抽提注意事項
⒈從少量的組織(1-10 mg)或細胞(102-104)中分離RNA 樣品:往組織或細胞中加入800 µl TRIZOL。待樣品裂解后,加入氯仿并進行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前,加入5-10μg無RNA酶的脂質體(CatNo 10814)作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。脂質體會留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不會抑制第一絲狀體的合成也不會抑制PCR。
⒉在勻化后和加入氯仿之前,樣品可以在–60-–70°C保存至少一個月。RNA沉淀(步驟4,RNA洗脫)溶于75%的乙醇在2-8°C至少可以保存一周,在–5-–20°C下至少可保存一年。
⒊臺式離心機最大能達到2,600×g的離心力,如果將離心時間延長到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。
蘇州阿爾法生物提供的Trizol試劑、RNA提取試劑盒等可以快速提取人、動物、植物、細菌不同組織的總RNA。
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