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原生質體葉肉細胞瞬時表達方法

時間:2022/12/16閱讀:1127
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1、 生長培養(yǎng)好的試驗材料(一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片)

2、 在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)

3、 切取葉片為0.5-1mm的細條(如果材料能達到每克107個原生質體, 10-20片葉子需要5-10mL酶解液)

4、 迅速將切下的樣品轉到酶解液中,要求全部浸沒。

5、 黑暗條件下抽真空30min

6、 連續(xù)酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h

7、 利用光學顯微鏡檢查原生質體(30-50μm大小)

8、 在過濾前加入等量的W5溶液

9、 洗干凈濾網,并用W5潤濕,之后過濾

10、 離心100g1-2min沉淀原生質體,盡可能吸走上清,重復洗2 

11、 重懸原生質體于W5中,保持在2*105 /ml,冰浴30min

12、 100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約 2*105/ml

13、 加入10μL質粒(1000ng-2000ng )于2ml離心管中

14、 加入100μL原生質體(2*104個),輕輕混勻。

15、 110μL PEG solution,輕彈使充分混勻

16、 23℃室溫孵育30min

17、 400-440μL W5混勻,終止反應

18、 100g2min 23℃離心,去上清,重復洗一次

19、 1mL W5重懸原生質體并放入6孔板中培養(yǎng)

20、 20-25℃孵育16h以上

21、 取樣制片觀察


溶液配制:

1、 酶解液的配制(20ml


試劑終濃度質量/g
MES20mM0.08528KOH調pH5.7
D-Mannitol0.4M1.45736
KCl20mM0.02982
macerozyme R-100.40%0.08
Cellulase R-101.50%0.3
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑
CaCl2·2H2O10mM0.029402
BSA0.10%0.02




W5溶液配制(500mL


試劑終濃度質量/g
MES2mM0.19524KOH調pH5.7
NaCl154mM4.49988
CaCl2·2H2O125mM9.18825
KCl5mM0.186375
MMG配制(100mL


試劑終濃度質量/g
MES4mM0.078096KOH調pH5.7
D-Mannitol0.4M7.2868
MgCl2·6H2O15mM0.30495
PEG配制(10mL


試劑終濃度質量/g
PEG 400040%4
D-Mannitol0.2M0.36434
CaCl2·2H2O100mM0.14701

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