當前位置:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司>>技術文章>>原生質體葉肉細胞瞬時表達方法
1、 生長培養(yǎng)好的試驗材料(一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片)
2、 在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)
3、 切取葉片為0.5-1mm的細條(如果材料能達到每克107個原生質體, 10-20片葉子需要5-10mL酶解液)
4、 迅速將切下的樣品轉到酶解液中,要求全部浸沒。
5、 黑暗條件下抽真空30min。
6、 連續(xù)酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、 利用光學顯微鏡檢查原生質體(30-50μm大小)
8、 在過濾前加入等量的W5溶液
9、 洗干凈濾網,并用W5潤濕,之后過濾
10、 離心100g,1-2min沉淀原生質體,盡可能吸走上清,重復洗2 次
11、 重懸原生質體于W5中,保持在2*105個 /ml,冰浴30min。
12、 100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約 2*105個/ml
13、 加入10μL質粒(1000ng-2000ng )于2ml離心管中
14、 加入100μL原生質體(2*104個),輕輕混勻。
15、 加110μL PEG solution,輕彈使充分混勻
16、 23℃室溫孵育30min。
17、 加400-440μL W5混勻,終止反應
18、 100g,2min 23℃離心,去上清,重復洗一次
19、 用1mL W5重懸原生質體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、 20-25℃孵育16h以上
21、 取樣制片觀察
溶液配制:
1、 酶解液的配制(20ml)
試劑 | 終濃度 | 質量/g | |
MES | 20mM | 0.08528 | KOH調pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
KCl | 20mM | 0.02982 | |
macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑 | |||
CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
BSA | 0.10% | 0.02 | |
W5溶液配制(500mL) | |||
試劑 | 終濃度 | 質量/g | |
MES | 2mM | 0.19524 | KOH調pH5.7 |
NaCl | 154mM | 4.49988 | |
CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
KCl | 5mM | 0.186375 | |
MMG配制(100mL) | |||
試劑 | 終濃度 | 質量/g | |
MES | 4mM | 0.078096 | KOH調pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 | |
PEG配制(10mL) | |||
試劑 | 終濃度 | 質量/g | |
PEG 4000 | 40% | 4 | |
D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 | |
CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 |
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