PCR產物的克隆-DNA回收實驗步驟
【實驗原理】
1.DNA片段回收方法:DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中,通上一定電壓進行電泳,不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠,用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2.利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3’T突出端的載體,在連接酶作用下,可以把PCR產物插入到質粒載體的多克隆位點,可用于PCR產物的克隆和測序。
商品化的T載體有很多。本實驗采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。這個載體以pUC19載體為基礎,消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點,經EcoRⅤ酶切后在兩側的3'端添上“T"制備而成(見附錄1)。由于本載體上消除了多克隆酶切位點,克隆后的PCR產物將無法使用載體上的限制酶切下,需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。
【試劑與器材】
(一)試劑
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)。
2.TAE電泳緩沖液
3.瓊脂糖(Agarose)
4.6×電泳加樣緩沖液:0.25%溴粉藍,40%(w/v) 蔗糖水溶液,貯存于4℃。2 / 9
5.溴化乙錠(EB)溶液母液:配制成10mg/mL,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。
6.70%乙醇
7.膠回收試劑盒(Omega公司)
(二)器材
水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 凝膠成像系統或其它照相設備。
【操作方法】
?。ㄒ唬┠z回收試劑盒回收PCR產物(以Omega公司Gel Extraction Kit為例)
1.當目的片段DNA分離時,轉移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。
2.凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中,稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積(假設其密度為1g/ml)。加入等體積的Binding Buffer(XP2),于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠融化,每2-3 min振蕩混合物。(在凝膠溶解之后,注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話,DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色,則要加入5μl 濃度為5 M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色
3.取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(已備好)。
4.將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。
5.如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,一次只能轉移700ul至柱子中,余下的可繼續重3 / 9
復第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
6.棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中,室溫下,10,000 x g下離心1min。
7.棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。(濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的,須將其拿出置于室溫下)。
8.重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
9.棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘余的液體。
10.把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上,加入15~30μl(具體取決于預期的終產物濃度)的Elution Buffer(或TE緩沖液)到柱基質上,室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。如果再洗脫一次的話,可以把殘余的DNA洗脫出來,不過那樣的濃度就會較低。
(二)連接反應(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例)
1)在微量離心管中配制下列DNA溶液,全量為5 μl。
pMDTM18-T Simple Vector1 μlInsert DNA0.1 pmol~0.3 pmoldH2Oup to 5 μl4 / 9
2)加入5 μl(等量)的Solution I。
3)16℃反應30分鐘。(2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時,連接反應時間請延長至數小時)。
4)全量(10 μl)加入至100 μl 感受態細胞中,冰中放置30分鐘。
5)42℃加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。
6)加入890 μl LB培養基,37℃振蕩培養60分鐘。
7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養,形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
8)挑選白色菌落,鑒定載體中插入片段的長度大小。
【注意事項與提示】
1.使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復使用,其PH的升高會減少產量。
2.不論采取何種方法回收DNA,在回收過程中,要盡量減少洗脫體積,以便提高收得率和濃度,以方便后續操作。
3.從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm),以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
4.連接反應時間是與溫度密切相關,因為反應速度隨溫度的提高而加快。通??刹捎?6℃連接4小時為宜,如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率;在選擇反應的溫度與時間關系時,也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
5.連接反應的整個過程應注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染,為防止酶活性降低,取酶時應在冰上操作且動作迅速。
6.連接反應應在25℃以下進行,溫度升高較難形成環狀DNA,影響連接效率。長片段PCR產物(2kb以上)進行連接時,連接反應時間應延長至數小時。
7.進行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
8.用高效的感受態細胞(轉化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。
9.試劑盒配有Control DNA。通過對照實驗判斷試劑盒的保存效果。
【實驗安排】
第一天下午:配制6×電泳加樣緩沖液、TAE等緩沖液,將各種耗材滅菌。
第二天上午:制備瓊脂糖凝(1%),電泳檢測,切膠回收DNA片段
第二天下午:大腸桿菌制備感受態細胞;DNA與T載體連接轉化大腸桿菌。
第三天上午:觀察轉化結果(藍白斑情況),計算重組率。
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