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Skin-on-a-Chip：Transepithelial Electrical Resistance

And Extracellular Acidification Measurements

Through an Automated Air-Liquid Interface

皮膚是人體重要的器官，在保護人體內部器面起著至關重要的作用。因此，人們進行了大量的工作來創建人造表皮模型進行體外皮膚毒性試驗。這些組織模型被稱為重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE），被用于在制藥、化妝品和環境領域中評估皮膚暴露于外源性物質中的毒性研究。在這里，我們提出了一個無標記的方法，即利用了intelligent lab for in vitro diagnostics（IMOLA-IVD）一個無創、基于傳感器的平臺，來檢測多孔膜上RhE細胞模型和貼壁細胞的跨上皮細胞層電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）。首先在聚碳酸酯膜上培養小鼠成纖維細胞作為測試模型，使用定制的生物芯片封閉式設計，以及雙微流道結構，用于培養物的連續和自動灌流。檢測L929細胞的胞外酸化率（Extracellular acidification rate，EAR）和跨上皮細胞層電阻（transepithelia lelectrical resistance，TEER）。通過該平臺監測RhE細胞模型的TEER超過48小時。TEER和EAR測試表明，該平臺可以長時間穩定培養芯片上的皮膚細胞模型，監測代謝參數，以及組織降解。        

Keywords：TEER；Organ-on-a-Chip；skin models；reconstructed human epidermis；impedance；label-free monitoring

1.       INTRODUCTION

作為人體最大的器官，皮膚代表著人體內部和外部環境之間的結構學屏障，將體內器官與毒素、病原體隔離開來，并保護內部器官免受紫外線（UV）輻射。除了重要的屏障功能，人體皮膚還執行人體的幾個基本功能，如熱調節、感覺和排泄。因為皮膚是人類抵御外部環境的影響的第一防護罩，新的化學物質的研究，如藥物和毒素，必須分析和評估其對調節皮膚完整性的能力。調查在這些化合物的影響下，細胞生物學利用細胞培養模型，更深入的研究了解由化學物質調節的細胞行為。在過去的十年里，科學家開發了各種生物工程模型用于皮膚毒性研究。第一個皮膚模型基于傳統的二維（2D）共培養模型，角質細胞接種到培養好的成纖維細胞上。由于在剛性塑料上培養不能長時間維持上皮細胞，而且阻止了細胞分層，組織工程界開發了3D皮膚模型來再現體內類似結構，并通過整合氣液界面設計了一個更具有生理相關性的環境。

人的皮膚由下列初級層組成，它們具有附屬的功能：表皮層、真皮層和皮下組織。將不同皮膚層整合到細胞模型中，目前的皮膚模型可分為含角質細胞的重建人表皮模型、含角質細胞和成纖維細胞的代表真皮和表皮隔層的全層模型，以及帶有額外細胞類型（如黑素細胞、干細胞等）的全層模型。由于其結構簡化，重新建立人表皮（RhE）模型具有較高的重現性，因而被廣泛接受。RhE細胞模型由人源性角質細胞接種在聚碳酸酯半透膜上，并將其納入細胞培養系統，置于標準孔板中，如商業化的Transwell®系統（Corning Inc.，Corning，NY，USA）。該裝置將培養物放置在氣液界面，皮膚表面暴露在空氣中，形成生理環境類似的培養條件。目前，有開放的皮膚模型，以及商業的模型，如EpiDerm™（MatTek in vitro life science laboratories, Bratislava, Slovak Republic），EpiSkin™（EpiSkin, Lyon Cedex, France），SkinEthic™（EpiSkin），EpiCS®（CellSystemsGmbH，Troisdorf，Germany），和LabCyte（Japan Tissue Engineering Co., Ltd. [J-TEC], Aichi, Japan）。ALEXANDRA協會遵循非營利性的方法，為制作和測試開放的3D皮膚模型提供了方案。

2. Background

2.1. 基于重構人表皮的皮膚毒性試驗的最新進展

從監管角度來看，評價和預測有毒化合物和藥物對皮膚的有害影響，3D模型系統必須經過一系列廣泛測試化合物的驗證。如果通過歐洲替代方法驗證中心 （ECVAM） 證實和經濟合作與發展組織（OECD）測試指南（TG），具有測試技術的模型就可以作為可接受的工具用于皮膚毒性測試。到目前為止，OECD提供了用于皮膚腐蝕和刺激的指南測試的指南，分別基于OECD TG 431和439。

2.2.器官芯片平臺和微生理測量

由于目前的模型在生物學的相關性上，只提供有限的意義，所以毒理學領域測試正朝著實現器官芯片（Organ-on-Chip，OOC）儀器的方向發展。器官芯片系統描述了一種包含灌注小室的微流體細胞培養裝置，在生理相關條件下培養活細胞。然而，大多數OOC平臺仍然嚴重依賴端點分析方法，缺乏的不同時間點的測試方法。此外，化學標簽，如熒光標簽可能會潛在地影響細胞代謝從而改變實驗結果。因此，采用無標簽技術的實時讀數的集成設備，對于測量進行空間和時間解析的是非常有意義的。

２.３. 皮膚/重建人表皮的跨上皮細胞層電阻

由于潛在的有害化合物會影響皮膚厚度，厚度的測量也是早期研究的參數之一。破壞性測量，例如活組織檢查，或非破壞性測量，如共焦拉曼光譜儀和超聲波成像。其中方法和有用的細胞培養的應用就是測量皮膚通透性屏障，以評估上皮或內皮組織的活力和功能。在這里，跨上皮細胞層電阻（TEER）提供了一種無標記和快速的技術來研究皮膚完整性。TEER值代表了一層或幾層細胞層的電阻值。

２.４. 目前跨上皮細胞層電阻測量的缺點和跨上皮細胞層電阻自動化測量的需要

除了微加工方法，還有一些商業上可用的外部測試系統，如“伏特-歐姆計"（World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）,，它可以現成的。由于缺少與細胞培養系統的整合，研究人員需要手動將細胞培養物從生物培養箱放到測量系統。這個過程缺乏重現性和標準化，也不能提供高通量測量的能力。雖然下一代的電極室（如Endohm室）可以直接測量，但是培養基以及試劑都必須手動加入，用于長期培養和藥物研究案例。因此，擴展的研究是不可能的，因為舊的介質不能從培養系統中取出，也沒有自動灌注新鮮的培養基。總而言之，目前的TEER測量系統仍然嚴重依賴手動操作和手持式系統，影響了測量的穩定性，從而影響了整體實驗的再現性。經濟合作與發展組織（OECD）認為，一個可接受的測試方案，分析重現性是驗證中的一個基本標準。因此，TEER領域通過集成自動TEER監控和采集，系統能夠在培養基頻繁變化的情況下執行編程模式測量，也非常有意義。

在此，我們介紹了一種新的自動監測測試和采集數據的微生理測量系統（IMOLA-IVD，德國cellasys）用于TEER測量。通過一個密封設計的商業化，用聚碳酸酯膜培養的表皮細胞RhE細胞模型。應用TEER測量用于研究RhE培養，并集成到自動化的流體平臺，可以精確灌注培養基和加藥。此外，我們能夠監測細胞外酸化率（extracellular acidification rate， EAR）。實證研究的目的是通過集成自動化灌流系統和集成測試平臺，實現實時動力學測量，同時保證測量穩定性。本研究演示了一種評估皮膚完整性的無創的測量方法的驗證和應用。

3．Materials and Methods

3.1. 體外診斷智能移動實驗室概述  

IMOLA-IVD是一種芯片上的實驗室測量系統，用于自動監測L929小鼠成纖維細胞和EpiDerm™重建人表皮細胞模型的TEER和EAR。IMOLA-IVD的基本操作已經在之前的工作中進行了描述，簡單地說，每個IMOLA-IVD包括一個電源、模擬和數字模塊，以及一個集成了傳感器的生物芯片，該傳感器被動地監測細胞模型的微環境。標準的IMOLA-IVD實驗是通過裝載數據采集和鏈接應用DALiA 2.0軟件的個人計算機實現自動化的，以控制一個蠕動泵和連接6個IMOLA-IVD系統的微流控通路。泵在ON和OFF狀態之間循環。在OFF泵關閉周期，細胞能夠代謝培養基中的營養物質；在ON泵打開周期，營養豐富的培養基被灌流到細胞中。

3.2 改進的BioChip-D小室

生物芯片模塊包含一個傳感器芯片連接到電路板并連接到一個圓柱形密封小室，用以保護芯片的連接并連通細胞及培養基。一個流體頭直接連接密封小室，形成一個液體密封、靜態微容積（~ 6μL）的反應室，在集成的傳感器表面測量細胞外酸化率（EAR）和氧合作用 （圖1a）。然而，需要測量RhE的情況下，多孔膜上培養的細胞不適合標準生物芯片或標準的IMOLA-IVD叉指電極傳感器（IDES）測量電阻。為了克服這些限制，新的密封小室和流體頭的設計，以保持空氣-液體使用Pro/Engineer Wildfire 4.0 （PTC Inc., Needham, MA, USA）。密封用Ultimaker 2 （Ultimaker BV，Geldermalsen，Netherlands），使用聚乳酸（PLA）和硅橡膠醫用粘合劑（Corning Inc., New York, NY, USA）連接到生物芯片BioChip。重新設計的BioChip小室適用于擴大培養室和其他多孔膜上培養的細胞（圖1b）的RhE。

3.3. L929細胞與重建人表皮細胞的制備與培養

記錄小鼠成纖維細胞（L929）和重建人表皮細胞（RhE）的跨上皮細胞層電阻值。L929細胞在加10%胎牛血清（FBS） 和10 μg/ml gentamycin （Thermo Fisher,Waltham, MA, USA）。細胞按照標準的實驗室規范（GLP）培養，并保存于37℃和5%的培養箱中培養后，在95%融合度時，細胞傳代，100,000細胞種在12mm Transwell®上，孔徑3 μm的多孔膜（Corning Inc.）。transwell隨后被放置在6孔板上，并在1ml DMEM中再孵育24小時，然后轉移到modified BioChip中。L929細胞是我們實驗室的標準細胞系，用于驗證實驗。

將EpiDerm™RhE細胞模型轉移到6孔板上，并在5.5mm/5mL的MatTek無血清長期培養基（#EPI-100-NMM-250） （MatTek in vitro life science laboratories）。每48小時交換一次培養基，直到轉移到BioChips中TEER實驗。實驗開始前24 h，將培養基減少到0.9 mL然后放在12孔板里。Modified BioChip-D在70%乙醇中室溫滅菌處理20 min后，用無菌去離子水沖洗。生物芯片灌流無緩沖DMEM處理24 h以穩定溫度，然后將膜培養物放置在芯片上。

3.4. 自動化灌流系統的介紹

設計了一種自動灌流系統來自動化監測在生物芯片上培養48小時以上的RhE細胞模型的TEER。該系統由兩個流體模塊（FM）組成，通過與Tygon® E-3603 （ProLiquid GmbH, Ueberlingen, Germany）管道連接成獨立的管道。這些獨立的網絡通過IMOLA-IVD泵標準設置的ON/OFF開關程序，向基底細胞提供營養豐富的細胞培養基，并定期向Transwell®膜的頂部區域，泵入磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）。如圖2所示。培養基流入模塊在無緩沖的DMEM和0.2%SDS的培養基之間切換，提供給膜底部的細胞。TEER測量模塊連接到PBS進行TEER測量或測試可用于接種RhE表面的水溶性測試物。

L929細胞培養在多孔膜小室上，RhE細胞模型培養在Modified BioChip-D上，通過無緩沖的DMEM與灌流泵進行36小時周期的培養。對于L929細胞，為監測細胞酸化，泵ON時間為5分鐘，而泵OFF時間為5分鐘、10分鐘、30分鐘和55分鐘。對于RhE細胞模型，泵周期為5分鐘ON, 10分鐘OFF, 5分鐘ON, 25分鐘OFF, 5分鐘ON, 10分鐘OFF。在25分鐘的泵OFF階段，通過將PBS泵入膜頂部小室，在芯片上的電阻傳感器和流體頭部的導線電極之間建立電路連接，記錄TEER測量。以60 μL/min的速度將750 μL的PBS泵到芯片上的膜上，然后以120μL/min的速度去除。TEER測量是在25分鐘泵關閉期間進行的。在預定的穩定測量周期后（L929細胞和RhE細胞模型分別為47和36小時），將0.2% SDS無緩沖DMEM泵入芯片作為陽性對照。用SDS培養基灌注至少12小時，以證實對照組對測得的TEER的影響。

4. Results and Discussion

4.1. 重新設計的經上皮電阻密封功能

將多孔膜插入培養室，確定培養室體積為~170 μL。匹配樣機通過膜下形成的入口孔灌注到腔內，膜底部的孔允許新鮮營養物質被動地擴散到細胞的基底層和細胞的廢物擴散出細胞。在泵ON循環期間，營養消耗后的培養基泵出腔室（圖2）。RhE培養物的頂端表面暴露于環境空氣中，經過長時間的培養，刺激分化成一個ALI的分層。為了測量這些培養物的TEER，重新設計的流體頭包含一個雙向的入口/出口閥，周期性地分配一定量的PBS溶液。這種方法連接多孔膜頂端腔的導線電極（見圖1b）和傳感器芯片上的平面IDES電極之間的電路。溢流閥使TEER電極淹沒在穩定的培養基體積中，防止溢流。連續5分鐘記錄膜的TEER，然后在測量之后取出PBS以維持ALI。

4.2. 小鼠成纖維細胞的胞外酸化率的測定

使用自動測量程序實時測量EAR，將L929細胞生長在聚碳酸酯膜。用未緩沖的DMEM以50 μL/min的速率灌注L929細胞。圖3顯示了在泵交替階段測量的pH值（以mV為單位）。紅色條表示泵OFF階段，灌流新鮮培養基，細胞活躍地將營養物質代謝為酸性廢物，生物芯片上的金屬氧化物傳感器會檢測到這些代謝物。綠色條表示泵ON階段。在此階段中，膜底部灌注新鮮培養基，提供營養給膜上培養的細胞。從圖中可以看出，當培養基酸化時，泵OFF階段55分鐘內，電壓會增加~5 mV，而較短的時間內不會產生明顯的電壓變化。

4.3. 小鼠成纖維細胞對十二烷基硫酸鈉培養基的代謝反應

一旦泵ON周期結束，測量的電壓迅速下降，直到達到基線（穩態）值。在下降之前存在一個短暫的延遲，這可能是由于新鮮培養基與芯片上已有的酸化培養基之間的混合導致的，因為出口的位置高于進口。在58小時，測量的信號下降。這可能是由于細胞膜破裂和細胞內內容物釋放到培養基中。在56小時，細胞已經溶解，因此不會產生廢物酸化周圍的介質，導致在55分鐘泵OFF階段信號變平坦。圖4描述了在實驗持續時間55分鐘OFF階段持續測量EAR。可以看出，加入SDS后，EAR突增，然后迅速降至零以下，表明細胞裂解。然后它逐漸趨近于零，直到實驗結束。

4.4. 小鼠成纖維細胞的TEER（跨上皮細胞層電阻）監測

除了監測L929細胞的代謝率，在25分鐘泵OFF期間還可以監測TEER值。在TEER測量過程中，隨著PBS泵入測量小室以連接電路進行測量，數值會發生變化。TEER開始無數值，因為電極對之間存在斷路。嵌入在流體頭的導線電極浸入PBS中，與膜下的芯片上的導電電極一起連接形成電路。PBS在細胞上停留5分鐘，泵OFF以進行穩定監測。然后PBS被泵出測量小室，直到下一個測量循環。

圖4顯示了從25小時開始測量的EAR和TEER。在泵OFF階段，EAR由線性回歸計算。表1總結了SDS加入前和加入后的結果。實驗開始24小時后，實測的實數電阻穩定在190歐姆附近，虛部電阻為-40歐姆。因為已知L929小鼠成纖維細胞在培養中保持單層，預計電阻將穩定在一個低水平。暴露于0.2% SDS培養基8小時后（時間為第 56小時），實數電阻下降14.8%，對應加入SDS導致的細胞死亡。虛部電阻下降6.11%。這些結果表明，開發的密封設計和泵模塊能夠進行自動化電阻測量。

4.4. RhE細胞模型的TEER（跨上皮細胞層電阻）監測

使用上述相同的設置對重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）進行連續監測TEER約50小時。在前12小時，TEER值保持相對穩定，如圖5所示。在36小時后，用0.2% SDS處理細胞后2小時，平均TEER值突然下降。（b）SDS培養基加入前，TEER值最初是直線增加的，在用PBS加入頂端腔后，然后迅速穩定并保持，直到5分鐘的測量周期結束。當從上部小室中移除培養基后，由于電路短路，TEER再次變成無數值。

在換到SDS培養基2小時后，TEER曲線的變化就可以被檢測到。起初，TEER值與加入SDS培養基前相同。但是TEER值在測量期間穩步下降，直到穩定在一個更低的值。這導致測得的平均TEER降低，這與加入SDS引起的細胞裂解吻合。此外，隨著SDS培養基加入時間的增加，電阻的初始峰幅值減小。盡管暴露于SDS，最初的峰值的持續似乎表明細胞存活。值得注意的是，以前的IMOLA-IVD研究是在簡單的單層細胞上進行的，相對較低濃度的0.2% SDS就可以較短的時間內殺死細胞。而更加嚴重細胞裂解過程相對緩慢可能歸因于更復雜的3D皮膚模型中培養的細胞的生命力的增強。

5. Conclusions

在這里，我們提出了一種創新的方法，以非侵入性監測細胞培養在二維和三維多孔膜在各種形態。生物芯片密封設計被證明支持小鼠成纖維細胞的單層，以及更復雜的重建人表皮細胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）。此外，設計了一個兩部分的自動化流體系統，處理將PBS溶液輸送和加入到頂部腔室進行TEER測量。使用L929細胞，設計了一個標準的操作方法，通過定期測量TEER來監測代謝率和屏障完整性。SDS培養基加入之前保持的細胞活力，作為陽性對照。

在用L929細胞進行初步試驗后，對重建人表皮細胞模型的TEER進行監測。TEER值顯示皮膚模型可以培養至少24小時，加入SDS培養基后的細胞裂解也會延遲。在以后的實驗中可以使用更高的SDS濃度來提高對照的響應時間。總的來說，這項工作是一項概念驗證實驗，證明了IMOLA-IVD用于復雜3D組織模型的能力，作為非侵入式自動化細胞分析的工具。值得注意的是，這項工作還提出了一個維持ALI的自動TEER測量的方法。