5
ELISpot檢測INF-γ 酶聯免疫斑點
IFN-γ（干擾素-γ）主要產生于激活的T細胞和NK細胞。TH1型響應的特點是通過輔助T細胞和細胞毒T細胞產生IFN-γ，所以高水平IFN-γ的產生是由于寄主應對細胞內的病原體產生了有效的防御。
酶聯免疫斑點法通常用于評估抗原特異的T細胞的功效，即檢測IFN-γ的釋放。酶聯免疫斑點法是一種非常靈敏的免疫檢測方法，它可以在單細胞水平檢測細胞因子的分泌。酶聯免疫斑點法是靈敏的細胞檢測方法之一，它檢測的靈敏度可以達到1：100 000個細胞。依賴于化學物質的分析，酶聯免疫斑點分析可以比傳統的ELISA靈敏20到200倍。
一、材料和試劑
1. ELISpotKits
（1）Mouse IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3321-2A）
（2）Human IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3420-2A）
注釋：以上的ELISpotKits可用性已經經過作者測試，用戶也可以用按自己的需要換別的替代。
2. 其它材料
（1）SIGMAFASTTM BCIP/NBT（Sigma B5655）
（2）1×Phosphate Buffered Saline（PBS）
（3）Wash Buffer：1×PBS，0.1%Tween-20（Santa cruz biotechnology，sc-29113）
（4）Phorbol 12-myristate13-acetate（PMA）（Sigma 79346）
（5）鈣離子載體Ionomycin（SigmaI 9657）
二、設備
1. biosys Bioreader 7000
三、步驟
1. 天：準備ELISpot板（無菌環境）
（1）用無菌的PBS，pH7.4，稀釋包被抗體（AN18）（16 μl 抗體稀釋在8 ml PBS，1：500）。
（2）把ELISpot板從包裝里拿出來，每個孔加75 μl 抗體溶液，4-8℃過夜孵育。
2. 第二天：在板上孵育細胞（無菌環境）
（1）倒掉過多的抗體，用無菌的WashBuffer（PBS-T）洗板5次，每個孔250 μl。
（2）每個孔加250 μl 的培養基，培養基中包含與用于懸浮細胞的培養液相同的10%的血清（通常是FBS），置于室溫孵育至少2個小時。
（3）倒掉培養基，并加入含有誘導物的細胞懸浮液。
一般要做如下幾組：不含誘導物的細胞、混有抗原（蛋白或多肽）的細胞和含PMA（10 ng/ml）和鈣離子載體Ionomycin（500 ng/ml）的細胞（陽性對照）。每個孔中的細胞數目決定于你的樣品中IFN釋放細胞的比例，通常是從2×104到2.5×105。如果靶細胞是多肽脈沖T2（T2pulsedwithpeptide）或瘤細胞，那么T細胞/靶細胞的比例需要滿足達到佳的檢測效果。
（4）把板置于37℃濕潤的培養箱，CO2的濃度為5%，培養12-48小時。在這期間不要挪動板，并設法避免蒸發。
3. 第三天：在板上孵育細胞（無菌環境）
（1）倒空板上的細胞，每個孔加250 μl 的水，保持在冰上10分鐘。
（2）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（3）稀釋檢測抗體（R4-6A2-biotin）至濃度為0.5-1 μg/ml（4 μl 抗體稀釋在8 ml PBS，1：2 000）。用加有0.5%FBS的PBS稀釋。每個孔加75 μl，37℃下孵育2個小時。
（4）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（5）用PBS-0.5%FBS稀釋Streptavidin-ALP（1：1 000），每個孔加100 μl，室溫孵育1個小時。
（6）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（7）在10 ml ddH2O中溶解一片BCIP/NBT即配成底物溶液，每個孔加100 μl。
（8）把板放在黑暗中反應，直到有清楚的斑點顯示出來。
（9）用大量的自來水清洗終止顏色反應。如果有必要，把板從盤里取出來漂洗干凈底下的膜。
（10）晾干板，用biosys Bioreader 7000或在解剖鏡下（不推薦）檢測并統計斑點數。
（11）板在避光的條件下室溫保存。
ELISpot檢測INF-γ 酶聯免疫斑點