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siRNA（小干擾RNA）是一種新型的基因治療工具，是由21-25個核苷酸組成的雙鏈短RNA分子，能夠特異性地誘導(dǎo)靶基因的沉默，進而抑制蛋白的表達。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動物細胞中的靶基因表達。

 

siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）發(fā)揮的。一條鏈被降解，另一條鏈則與靶基因的mRNA互補配對，使其被切割降解，從而達到治療相關(guān)疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比，siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點，可以應(yīng)用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤，病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。

 

為了方便使用，常規(guī)siRNA產(chǎn)品以凍干粉形式提供，可以直接用于各種細胞RNAi實驗。科研人員可以根據(jù)需要設(shè)計特定靶點，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時，通過對siRNA進行化學(xué)修飾，可以提高其在體內(nèi)實驗中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。

 

RNA干擾（RNAi）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，常常被用作基因沉默（基因干擾）的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。未來，siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其優(yōu)勢，成為治療相關(guān)疾病的新趨勢。

 

siRNA轉(zhuǎn)染實驗介紹

01- siRNA儲存

常規(guī)化學(xué)合成的siRNA序列為21～23nt的雙鏈小分子RNA，為凍干粉形式的即用型試劑 ，在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個月時間，放置于-20℃～-80℃低溫環(huán)境中，凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。

 

02- 轉(zhuǎn)染試劑儲存

4℃保存，不可冷凍。

 

03-體外轉(zhuǎn)染操作流程：

第一步、接種細胞：建議提前一天接種細胞，接種數(shù)量參考下方推薦量。

第二步、 轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：

● siRNA稀釋液配制：siRNA以水稀釋至140 μg/mL。

● siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：取無菌離心管，加入2μL siRNA稀釋液，加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑A液14μL，吹打混勻，加入LipidnanoTM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑B液4μL，混合均勻，室溫放置5min，加培養(yǎng)液180μL，吹打混勻。

第三步、細胞加樣：按下方推薦量將配制好的siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液加入各細胞孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。

第四步、細胞培養(yǎng)：37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測定mRNA水平、48~72h測定蛋白水平。