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液相色譜流動(dòng)相有哪些注意事項(xiàng)
流動(dòng)相是影響液相色譜的關(guān)鍵因素。一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，但是如何配制。選擇配制的方法不同，分析結(jié)果特別是保留時(shí)間，是會(huì)有顯著差別的。
高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液。常因資料上表示的內(nèi)容和實(shí)際的配制方法不同，而產(chǎn)生流動(dòng)相的差異，影響了色譜圖和分析結(jié)果。
一般來(lái)說(shuō)，溶劑的混合按體積比(V/V)或重量比(W/W)進(jìn)行。溶液的體積因溫度而變化，所以按重量比混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。只要沒(méi)有特別標(biāo)明，就可按體積比進(jìn)行混合，但在特殊情況下，如胺類(lèi)粘度高的溶液混合時(shí)，有時(shí)用重量—體積比(W/V)的方法。
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
1. 流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。流動(dòng)相溶解度達(dá)不到要求時(shí)，盡量選用流動(dòng)相中含有的比例較大的成分，以減輕進(jìn)樣對(duì)流動(dòng)相的影響造成基線不穩(wěn)。
2. 流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，選用流動(dòng)相配置對(duì)色譜峰影響最小。
3. 流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
4. 流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。流動(dòng)相組成溶劑均達(dá)不到要求時(shí)，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長(zhǎng)內(nèi)無(wú)紫外吸收。
5. 流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
6. 在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
下面21項(xiàng)注意讓你更懂液相流動(dòng)相
1. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意過(guò)濾溶劑
溶劑在使用前一定要用0.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動(dòng)相，過(guò)濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過(guò)濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性兩種過(guò)濾膜供選擇(反光面朝上)，過(guò)濾水溶性流動(dòng)相時(shí)(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤(rùn)濕過(guò)濾膜，有助于快速抽濾。
2. 注意保持儲(chǔ)液瓶的清潔
用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過(guò)程中留下污跡。
3. 注意保證溶劑的質(zhì)量
一定要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。
4. 注意流動(dòng)相脫氣不充分
流動(dòng)相受熱，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。
可試用下列方法解決問(wèn)題：
流動(dòng)相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。
系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡。
氣泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差;存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液存在于檢測(cè)器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。所以做液相對(duì)流動(dòng)相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。
氣泡會(huì)影響柱的分離效率，檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。(噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng))。
此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來(lái)誤差。
溶解氧能與某些溶劑(如，甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收(特別是在260nm以下)，并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。
在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中(特別是還原電化學(xué)法)，氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。
常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。
(1)氦氣脫氣：
氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過(guò)流動(dòng)相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動(dòng)相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護(hù)的流動(dòng)相可以認(rèn)為是一個(gè)無(wú)氣體溶解體系。
其缺點(diǎn)是氦氣價(jià)格比較昂貴，會(huì)增加檢驗(yàn)成本。一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
(2)真空脫氣：
也是比較常用的脫氣方法。現(xiàn)在多數(shù)企業(yè)這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。象Agileng1200液相色譜使用的是在線脫氣機(jī)。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相，在使用過(guò)程中的微量脫氣。
(3)超聲波脫氣：
將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡(jiǎn)便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時(shí)還會(huì)引起氣體溶解度的增加。對(duì)氧敏感的檢測(cè)器不宜用此法。
超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20~30min方可)，關(guān)于超聲時(shí)間問(wèn)題眾說(shuō)紛紜，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5～30分鐘不等，一般來(lái)說(shuō)流動(dòng)相組成為無(wú)機(jī)(緩沖鹽溶液)時(shí)，5～15分鐘即可，流動(dòng)相為是水和有機(jī)容積混合時(shí)，超聲時(shí)間要相對(duì)長(zhǎng)一些，這個(gè)方法只能除去30%的溶解氣體，時(shí)間的延長(zhǎng)不和效果成正比，且其中氣泡對(duì)色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來(lái)說(shuō)影響不大，15min超聲即可足夠。
此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
(4)加熱回流脫氣：
該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對(duì)于有機(jī)溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，改變流動(dòng)相的組成。
綜合來(lái)說(shuō)，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是穩(wěn)定辦法，用氦氣的方法是穩(wěn)定的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。
A. 離線(系統(tǒng)外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開(kāi)始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
B. 在線(系統(tǒng)內(nèi))脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來(lái)。此外還有在線脫氣機(jī)。
5. 注意流動(dòng)相供給不暢
流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。
應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動(dòng)。
過(guò)濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。
過(guò)濾器被微粒所阻塞或長(zhǎng)霉，去掉過(guò)濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說(shuō)明已找出問(wèn)題，換上新的過(guò)濾器則可。有時(shí)候換上新的過(guò)濾器仍然不暢，那就需要查查流動(dòng)相的制備過(guò)程，或者換大孔徑的過(guò)濾器。不管如何，流動(dòng)相都需要重新過(guò)濾。流速過(guò)高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過(guò)濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
使用下列方法解決：
(1)使用低流速;
(2)換大孔徑的過(guò)濾器;
(3)增加進(jìn)液管道內(nèi)徑;
(4)抬高或加壓儲(chǔ)液器;
(5)不用過(guò)濾器，但流動(dòng)相一定要先過(guò)濾;
(6)儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開(kāi)蓋子或留有1mm的縫隙;
(7)進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問(wèn)題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。
6. 注意防止流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染
由于污染，噪音越來(lái)越大，檢測(cè)器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來(lái)，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來(lái)一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。
新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長(zhǎng)霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專(zhuān)用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器。
流動(dòng)相污染來(lái)自這幾個(gè)方面：
試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格;
微生物的影響;
配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)龋虼艘蟾呒兌然瘜W(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑。
要注意玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈;
為防止微生物生長(zhǎng)，每天要用甲醇清洗系統(tǒng);
懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng));
真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相;
用清潔的惰性塞子、攪棒、過(guò)濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相;已經(jīng)污染的流動(dòng)相一定要廢棄掉。
7. 注意選擇流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)
低交聯(lián)度的離子交換樹(shù)脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
8. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意純度
色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
9. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意必須與檢測(cè)器匹配
使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。
10. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粘度要低(應(yīng)<2cp)
高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)，最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
11. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意對(duì)樣品的溶解度要適宜
如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。
12. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意樣品易于回收
應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
13. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
14. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意三倍規(guī)則
每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。
15. 選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)
當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
16. 流動(dòng)相的配制注意有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合方法
有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合液作為流動(dòng)相是經(jīng)常的，但由于混合方法不同，有時(shí)分析結(jié)果相差很大。如20mM磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的混合液，混合比為9∶1時(shí)，20mM 磷酸鈉緩沖液(pH2.5)90%與乙腈10%的體積比為9∶1，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當(dāng)量稱取后進(jìn)行混合。
另外，按10%乙腈解釋?zhuān)?0mM 磷酸鈉緩沖液(pH2.5)，將乙腈稀釋調(diào)制也可以成立。在后者情況下，產(chǎn)生混合體積減少部分，余下的添加20mM 磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒(méi)有太大的差別，但由于混合方式不同，分析結(jié)果，特別是保留時(shí)間，也會(huì)有顯著的差別，這點(diǎn)必須注意。
17. 50%或(V/V=1/1)乙腈水溶液的配制方法
對(duì)于用V/V=1/1的表示配制乙腈水溶液，多按這種方法進(jìn)行：用量筒測(cè)定乙腈500mL，用另一量筒測(cè)定水500mL，兩種液體在瓶?jī)?nèi)充分搖晃混合。不過(guò)50%乙腈水溶液的表示時(shí)，同樣也多是按上述方法配制，但查化學(xué)辭典時(shí)，實(shí)際上是按這種方法進(jìn)行配制：首先將500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達(dá)到室溫，用全量水，使溶液到1L。
這樣一來(lái)，用%表示和“V/V"體積比表示，最終得出的流動(dòng)相組成不同。也就是說(shuō)，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計(jì)算的單純平均值不相同，所以用上述兩種方法調(diào)制的流動(dòng)相組成差異。如在室溫(25℃)附近水50mL和乙腈50mL混合時(shí)體積不是100mL，而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡(jiǎn)便的第一種方法。
18. 流動(dòng)相的配制注意溶劑體積的溫度影響
溶液的密度受周?chē)鷾囟鹊挠绊憽倧娜軇├洳叵淠贸鰜?lái)的溶液溫度與實(shí)驗(yàn)室的室溫相比，要低不少，乙腈和水混合液因發(fā)熱反應(yīng)，溶液溫度升高。
因此，為能調(diào)制再現(xiàn)性好的流動(dòng)相，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調(diào)到接近室溫。
19. 流動(dòng)相的配制注意用兩臺(tái)泵進(jìn)行溶劑混合
雙泵主要是在探討流動(dòng)相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時(shí)，建議配好后使用的話，混合比較均勻，效果較好。在反相分析中，常用的有機(jī)溶劑和水的等濃度法，使用高壓兩元梯度系統(tǒng)，用兩臺(tái)泵將流動(dòng)相分別輸液后混合等封閉式混合時(shí)與預(yù)先在瓶?jī)?nèi)混合后用1臺(tái)泵輸液時(shí)，因混合后體積變化的不同，保留時(shí)間也有所不同，一定要注意。
不僅是流動(dòng)性的調(diào)制方法，試樣溶液和其他溶液的調(diào)制也經(jīng)常有上述問(wèn)題，另外，在不同部門(mén)(醫(yī)藥部門(mén)或化工部門(mén))各自都有自己的常識(shí)和習(xí)慣。在這種情況下，就要求各部門(mén)在制作相關(guān)溶液配制方法時(shí)能規(guī)定通則，定義設(shè)計(jì)溶液的調(diào)制方法，這樣避免混亂，以在日常工作中更好地記住這些表示方法。
20. 注意流動(dòng)相的pH
如需在一定PH值下操作，須定期測(cè)定流動(dòng)相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動(dòng)相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時(shí)這種影響可能更大。
21. 注意更換柱子及流動(dòng)相
軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時(shí)應(yīng)先用25~30倍柱容積的合適流動(dòng)相平衡。更換流動(dòng)相時(shí)，如果兩種流動(dòng)相不互溶，需采用過(guò)渡溶劑使前一種流動(dòng)相逐步溶解除去。例如，2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時(shí)，必須用乙酸已酯或其他溶劑過(guò)渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。