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　　起源于上世紀(jì)60年代末的高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，建立在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，開始了高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測器各技術(shù)不斷進步的旅程。解析真實世界的奧秘幾乎都要用到分離技術(shù);有機物構(gòu)成了物質(zhì)世界的絕大部分;而超過80%的有機物，大都采用HPLC進行分離和分析。因此，液相色譜構(gòu)成了科學(xué)儀器領(lǐng)域極大的單品類，其市場之大讓許多企業(yè)魂牽夢縈，無數(shù)企業(yè)前赴后繼地進入液相色譜市場。本文將簡要回顧高效液相色譜商用技術(shù)的進展，并在下篇簡述近年來的新產(chǎn)品，希望對您下次入囊前有些許參考。

　　HPLC技術(shù)誕生和發(fā)展

　　1903年，植物學(xué)家Tswett在會議上報道了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法(后來文獻發(fā)表于1906年)，Tswett將這種方法命名為色譜(Chromatography)，管內(nèi)填充物被稱之為固定相，沖洗劑被稱之為流動相。

　　1941年，Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙酰基氨基酸，Martin和Synge一同提出著名的色譜塔板理論，兩人獲得了1952年的Nobel獎。色譜塔板理論提出：理論板與液體流速和顆粒直徑的平方成正比，理論板越薄越好。因此，最薄的理論板應(yīng)該通過使用非常小的顆粒和整個柱長度上的巨大壓力差來獲得。[1]

　　液固色譜被創(chuàng)立后的50多年時間里，液固色譜裝置并無實質(zhì)性的改進，溶劑的流速依賴于重力，液相色譜系統(tǒng)效率低下。直到20世紀(jì)60年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，人們把氣相色譜中獲得的系統(tǒng)理論與實踐經(jīng)驗應(yīng)用于液相色譜研究。

　　1966年，耶魯大學(xué)的Horvath提出高效液相色譜(HPLC)的名稱[2]，后于1967年開發(fā)了第一臺高效液相色譜儀，開啟了HPLC的時代。1972-1974年，6000 psi泵、10µm粒徑色譜柱和無隔墊進樣器的引入，標(biāo)志著HPLC從“高壓"向“高效"的轉(zhuǎn)變。HPLC用細(xì)粒徑高效填充色譜柱，大大提髙了液相色譜的分離能力;采用高壓泵輸送流動相替代重力作用，使柱效更高，并提高液相色譜的分析速度;液相色譜與光學(xué)檢測器相結(jié)合，也使HPLC不僅可以分離，還可以同時完成分析任務(wù)。HPLC本身就是一套分離分析系統(tǒng)。

　　1966年，Csaba Horváth和Seymour(Sandy)Lipsky發(fā)表了HPLC的第一篇文獻，即核苷酸和甲狀腺化合物的離子交換分離

　　1973年，第一屆HPLC會議在瑞士因特拉肯舉行，1982年后每年舉辦。

　　20世紀(jì)70年代末至80年代初，HPLC開發(fā)了分離肽和蛋白質(zhì)的方法，為今日蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥分析奠定了基礎(chǔ)。

　　1979年至80年代初，開發(fā)了用HPLC分離對映體的方法，最初采用在流動相中加入修飾劑，后來開發(fā)了可分離對映體的固定相。

　　20世紀(jì)80年代中后期，John Fenn開發(fā)了ESI離子源，成功用于LC-MS。

　　2004年前后，引入< 2µm粒徑的新系統(tǒng)，推動耐壓15,000-20,000 psi的UHPLC的出現(xiàn)。

　　你所不知道的商用HPLC發(fā)展史

　　色譜柱技術(shù)

　　色譜柱技術(shù)是儀器開發(fā)的主要驅(qū)動因素之一。1967年，耶魯大學(xué)的Csaba Horváth和同事們在薄層填料(現(xiàn)稱為表面多孔填料，SPP)方面的工作代表了HPLC柱和儀器技術(shù)的突破。50微米的球形玻璃珠涂有一層薄薄的聚苯乙烯樹脂聚合物層(1-3μm)，衍生形成陰離子交換功能，并用于分離核苷酸。顆粒被裝入不銹鋼柱(內(nèi)徑1mm，長度3米)，這會產(chǎn)生高背壓，需要使用泵將溶劑推過柱。這代表一個開始的趨勢，即較小的顆粒會提高柱效，以提供更好的分離性能，同時也會增加柱背壓，使其與平均顆粒直徑成反比;因此，在接下來的幾年里，泵輸出壓力將成為一個重要因素。除此之外，流速、額外柱效應(yīng)(系統(tǒng)死體積)、峰寬減小、洗脫速度、樣品通量和檢測器能力等參數(shù)都成為改善HPLC系統(tǒng)所有部分的驅(qū)動因素。

　　第一臺HPLC的誕生

　　有案例表明，Horvath及其同事的突破性工作是HPLC的開始(當(dāng)時指的是高壓LC)。他們自制了梯度洗脫的系統(tǒng)，使用兩臺 Milton Roy 微型泵。梯度由一個含有弱溶劑的攪拌儲液池開始形成;然后由一個泵向該儲液池輸送受控但不斷增加的強溶劑量;第二臺高壓泵將越來越濃的溶劑混合物從儲液池推到色譜柱上;用一個帶有8μL流動池的改良分光光度計檢測。

　　1967年，他們與當(dāng)?shù)豍icker Nuclear儀器公司合作，推出LCS-1000——第一臺真正的商用HPLC。該設(shè)計由工程師Emmett Watson牽頭，他離開Waters成為一名顧問。LCS-1000有一個高壓泵(高達4000 psi)、一個進樣Loop閥、一個柱溫箱、裝有上述薄層填料的色譜柱，以及一個基于低壓汞蒸氣燈的固定波長檢測器(254 nm)。該儀器不適用于Picker Nuclear的非色譜產(chǎn)品范圍，1968年，該技術(shù)被Varian 公司收購(Varian后被安捷倫收購)。

　　1967年，Picker Nuclear公司推出第一臺商用HPLC：LCS-1000

　　1961年，陶氏化學(xué)公司的J.C. Moore請Waters公司開發(fā)產(chǎn)品，用凝膠色譜柱分析聚合物。Waters獲得Moore許可證后，于1963年推出了第一臺凝膠滲透色譜儀GPC-100，采用500 psi的泵。

　　1963年，Waters公司推出第一臺凝膠滲透色譜儀GPC-100

　　1967年，Waters推出HPLC系統(tǒng)ALC-100(ALC是分析液相色譜儀的首字母縮寫)，它改進了原有GPC-100系統(tǒng)，減少死體積，采用更高壓力的Milton Roy泵，流通紫外檢測器和(可選)和折射率(RI)檢測器。1968年P(guān)ittcon會議上，Waters推出ALC-100。Waters將其品牌口號“Ther Liquid Chromatography People“注冊成商標(biāo)，Waters公司成為了LC的代名詞。1972年，Waters的James Waters父子拜訪Robert B. Woodward 及其博士后Helmut Hamberger，分離維生素B-12合成過程中中間體的異構(gòu)體;從此HPLC打開了有機合成的市場。

　　1967年，Waters公司推出第一臺HPLC系統(tǒng)ALC-100，1968年P(guān)ittcon展出

　　色譜學(xué)家傾向于將HPLC的起源推至更早期的1964年。杜邦公司的Jack Kirkland參觀Eidhoven理工大學(xué)。在一間實驗室里，Josef F. K. Huber已在自制粗糙的HPLC儀器，帶有紫外檢測器，在GC顆粒上包裹液體(和流動相不混溶)后填充了色譜柱。參觀后，Kirkland說服杜邦公司的經(jīng)理讓他研制HPLC，進行GC無法全部勝任的農(nóng)藥分離。

　　1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀

　　1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀，有一個恒壓泵、一個自制的UV 254 nm檢測器(410型)和杜邦的ZIPAX SPP色譜柱。杜邦推出了第一批化學(xué)鍵合相，改變了梯度HPLC的實踐;他們的ZORBAX column產(chǎn)品仍然存在，現(xiàn)在由安捷倫科技制造和銷售。(杜邦于1986年退出HPLC儀器市場，隨后IBM儀器公司短暫進入該市場。)

　　日本的島津公司，1969年開發(fā)GPC系統(tǒng)，1972年與杜邦簽訂許可合同后開始制造銷售LC-1(LC-830)，1978年推出自主研制的LC-3A，以CDQR方式的單柱塞型送液單元為特征。

　　1978年島津推出LC-3A

　　進樣閥的演變

　　幸運的是，當(dāng)杜邦和Waters[3]將新的SPP填料(37-50μm粒徑范圍)裝入標(biāo)準(zhǔn)柱(內(nèi)徑2.1 mm，長度50或100 cm)時，背壓適中，因此第一臺商用液相色譜儀采用了在線GC隔墊進樣器。隨著填料顆粒變小，隔墊進樣器的耐壓能力不足，促使停流(stop-flow)技術(shù)的出現(xiàn)。這種手動進樣很麻煩，限制了樣品的通量，因此Valco的創(chuàng)始人Stan Stearns調(diào)整了GC閥，使進樣壓力達到4500 psi。六通進樣閥在生產(chǎn)率和重現(xiàn)性方面取得了真正的突破，并通過改變樣品Loop定量環(huán)尺寸，使進樣體積更靈活，還促進了后來進樣器的自動化。

　　1968年Valco推出6通進樣閥

　　Waters在其集成LC系列中使用了六通進樣閥后，1973年推出了自己的U6K進樣器，可進行方便、可變體積和可靠的進樣，并可實現(xiàn)自動化。該進樣器還具有一個創(chuàng)新的旁路通道，可在閥門循環(huán)時降低壓力沖擊，從而保護色譜柱在重復(fù)進樣后不會損壞。在早期，色譜柱的穩(wěn)定性較差，但隨著色譜柱填充方法的改進，問題也就不那么嚴(yán)重了。

　　1973年Waters推出U6K進樣器

　　后來，Rheodyne公司于1976年推出7125型進樣閥，對Valco方法進行了改進，使進樣器將樣品注射入閥的中心，可使用單個Loop環(huán)實現(xiàn)可變的進樣量。

　　1976年Rheodyne公司推出7125型進樣閥

　　模塊的崛起

　　早期的許多色譜用戶認(rèn)為，每個制造商各有優(yōu)勢，因而希望將泵與進樣器、檢測器等結(jié)合起來，目的是構(gòu)建一個具有快速可互換(或可升級)模塊的高級系統(tǒng)。為了滿足需求，一些制造商(尤其是OEM行業(yè)的制造商)決定開發(fā)可以優(yōu)化性能的獨立模塊。實驗室數(shù)據(jù)控制公司(Laboratory Data Control，LDC)，該公司還利用Emmett Watson的服務(wù)構(gòu)建價格合理的獨立模塊，包括254 nm紫外檢測器。該檢測器成為多家色譜公司的主要OEM組件。規(guī)模更大的Milton Roy公司收購了LDC，并成為許多HPLC公司和個人色譜儀的模塊供應(yīng)商。Valco和Rheodyne等零部件公司專門生產(chǎn)注射閥(進樣閥)和切換閥。Schoefel、Cecil Instruments和Pye Unicam等檢測器公司開發(fā)了專門的探測器。許多較小的公司開發(fā)了其他外圍設(shè)備，可以根據(jù)需要快速更換。

　　1968年LDC/Milton Roy推出模塊化組件

　　液相泵的發(fā)展

　　Waters緊隨模塊潮流，開發(fā)了一款名為M-6000的獨立泵，這是第一款專門為HPLC開發(fā)的泵。基于單活塞設(shè)計的早期泵輸送脈動流，因此需要脈沖阻尼系統(tǒng)，以降低流量敏感檢測器中的噪聲。然而，大量脈沖阻尼器延遲了梯度流動相到達色譜柱，增加了分析時間。M-6000使用了兩個往復(fù)式活塞，以便更平穩(wěn)地流向色譜柱。其6000 psi的額定壓力足以滿足20世紀(jì)70年代初引進的25 cm柱(內(nèi)徑4.6mm)中10微米粒徑填料的要求。

　　1972年Waters推出M-6000液相泵

　　Altex(后被貝克曼收購)開發(fā)了全新概念的泵，使用可變活塞速度和快速再充滿(refill)，由此產(chǎn)生的110型泵的流量比當(dāng)時大多數(shù)低成本的往復(fù)式泵都要平穩(wěn)。

　　1976年Altex公司推出110泵

　　為了提供更高的壓力和非脈動流量，瓦里安(后被安捷倫收購)、Isco和Nester-Faust(后被珀金埃爾默收購)選擇開發(fā)注射泵。在這里，大容量(250毫升)活塞由精確的步進電機驅(qū)動。這些泵基本上沒有脈沖，可以耐受高達6000 psi的高壓，后來達到8500 psi。對于二元梯度，需要兩個注射泵。但由于溶劑體積可壓縮性，色譜柱在梯度洗脫過程中遇到問題;進入混合器的每種溶劑的實際流量與控制器上的編程不同，這會產(chǎn)生成分錯誤——尤其是當(dāng)每臺泵的啟動體積不同時。注射器泵雖然新穎，但最終消失了。然而，注射泵值得一提，因為這項新技術(shù)試圖在提供無脈沖高壓流量時跳出框框思維。

　　1970年瓦里安推出4100/4200注射泵

　　你好，工業(yè)3.0

　　在20世紀(jì)60年代末和70年代初，主要的數(shù)據(jù)輸出靠條形圖記錄儀。對于定量，通常采用手動方法，如切割和稱重圖紙或使用機械求積儀。但Autolab改變了這一切，Autolab后來是SpectraPhysics(后被賽默飛收購又賣出，現(xiàn)屬Newport)的一個部門，它推出了System IV計算積分器，提供數(shù)字讀數(shù)。輸出可以表示為簡單的面積百分比或基于方法中存儲的校準(zhǔn)因子。由于其較大的動態(tài)范圍，色譜儀不再需要在調(diào)整信號衰減的同時進行多次進樣，從而提高了實驗室生產(chǎn)率。

　　1969年Autolab推出Autolab System IV計算積分器

　　由微處理器控制的惠普HP 3380A積分器更進一步，它既是記錄器又是字母數(shù)字打印機繪圖儀，因此所有信息都在一張圖表紙上。此后，許多制造商推出了自己的數(shù)據(jù)系統(tǒng)來補充HPLC硬件。

　　1974年惠普推出HP 3380A數(shù)字積分器

　　1979年，Nelson Analytical開發(fā)了基于個人電腦的數(shù)據(jù)分析軟件，利用新的大規(guī)模集成電路(LSI)構(gòu)建模數(shù)轉(zhuǎn)換器，并提供具有強大計算能力的儀器控制和數(shù)據(jù)采集。Nelson產(chǎn)品成為許多制造商系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)IBM PC推出時，Nelson對其軟件進行了調(diào)整，使其能夠同時進行儀器控制和數(shù)據(jù)處理，這一概念很快取代了后來液相色譜儀中的獨立積分器。

　　1979年Nelson Analytical推出用于液相色譜儀的PC軟件

　　在20世紀(jì)70年代中期，高效液相色譜法越來越多地被用于制藥和其它行業(yè)，用戶每天需要分析許多樣品。第一臺進入市場的HPLC自動進樣器來自Micromeritics公司，這是一家專門從事粒度測量的公司，他們于1974年推出708A型LC自動進樣器，使用旋轉(zhuǎn)托盤中的管狀小瓶。將一根針放入小瓶中，刺穿瓶蓋，同時一個套環(huán)將瓶蓋向下推入小瓶，將樣品送入進樣環(huán)中。該系統(tǒng)可對小瓶中進行1-3次取樣。到20世紀(jì)70年代末，大多數(shù)主要供應(yīng)商都推出了自己的自動進樣器。

　　1974年Micromeritics推出708AL型自動進樣器

　　集成液相系統(tǒng)的回歸

　　隨著HPLC被廣泛接受，儀器外圍設(shè)備的中央控制更有意義;模塊式LC概念正在失去支持，因為模塊之間無法相互通信。用戶還發(fā)現(xiàn)，對于分析含有多種成分的樣品，梯度洗脫是必須的，這是實現(xiàn)中央控制的另一個驅(qū)動因素。一種設(shè)計是產(chǎn)生二元梯度的雙泵系統(tǒng)(兩個泵在高壓側(cè)垂直連接在一起，需要一個混合器)。

　　惠普的分析部門(現(xiàn)為安捷倫科技)改進了兩年前收購的Hupe-Busch系統(tǒng)。HP 1084是第一款微處理器控制的LC，具有流量控制功能，并配有自動進樣器、紫外檢測器和外部熒光檢測器。1084的精確流量控制是很好的賣點，并具有高度可重復(fù)的保留時間。

　　1976年惠普推出惠普1084型液相色譜儀

　　由于兩個泵產(chǎn)生梯度系統(tǒng)的成本很高，瓦里安和Spectra Physics等開發(fā)商開發(fā)了早期的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品使用了低壓側(cè)帶有溶劑比例閥的單泵。因此，使用兩個或三個比例閥，可以生成二元或三元梯度，在方法開發(fā)過程中提供更大的靈活性。低壓梯度最終成為許多公司的標(biāo)準(zhǔn)，后來還開發(fā)了更強大的四元泵。1978年，瓦里安推出的LC-5000是第一款集成的高效液相色譜系統(tǒng)，它將低壓單泵梯度功能、關(guān)鍵功能的微處理器控制、用于設(shè)置方法的鍵盤和CRT顯示器集成在一個單元中。主動式進樣止回閥解決了止回閥粘性和注入損失的問題。1979年Spectra Physical推出的 Model 8000采用的設(shè)計與當(dāng)今儀器中使用的溶劑混合設(shè)計幾乎相同。

　　瓦里安LC-5000液相色譜儀

　　1975年，Dionex(后被賽默飛收購)作為Durrum Instruments的一個部門成立，以應(yīng)對一個新興的色譜市場：離子色譜(IC)。Dionex很快成為分離無機和有機離子化合物的被認(rèn)可品牌。他們產(chǎn)品由陶氏化學(xué)公司授權(quán)，包括：使用離子抑制器從流動相中去除鹽，對分離的離子進行電導(dǎo)檢測。Dionex還開發(fā)了專門的IC柱，用于嚴(yán)格分離如飲用水中的痕量溴酸鹽和鹵代氧化物，使用脈沖安培檢測器進行碳水化合物分離，以及離子排斥分離。

　　1975年Dionex推出Model 10離子色譜儀

　　多種色譜檢測器

　　HPLC的前些年，光譜檢測器占主導(dǎo)地位，停流掃描分光光度檢測器在市場上幾乎不被接受。采用DAD光電二極管陣列檢測器后，可進行實時光譜測量，并可以實時獲得完整的紫外-可見光譜，后來成為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1977年，惠普推出了第一個DAD檢測器8450，為此后的DAD檢測器設(shè)定了黃金標(biāo)準(zhǔn)。

　　1977年惠普推出8450 DAD檢測器

　　隨著GC-MS的巨大成功，各種液相色譜的接口類型被開發(fā)出來，以結(jié)合兩種顯然不兼容的技術(shù)——一種在液體環(huán)境中，另一種在真空中。接口技術(shù)包括直接液體接口、傳輸設(shè)備、粒子束、連續(xù)流FAB、離子噴霧和熱噴霧。

　　第一個獲得市場成功的是傳送帶接口，它借鑒了R.P.W.Scott[4]和Victor Pretorius[5]的早期工作，他們使用移動的電線將部分LC柱流出物輸送至火焰離子化檢測器(由英國Pye Unicam公司銷售)。第一個成功的LC-MS接口使用的不是移動的金屬絲，而是移動的傳送帶，可以傳輸更多的樣本，以獲得更好的靈敏度。在進入真空區(qū)之前，溶劑被加熱蒸發(fā)。1976年，F(xiàn)innigan MAT(后被賽默飛收購)推出傳送帶接口[6]，優(yōu)點是：該接口具有良好的EI光譜和良好的靈敏度;但缺點是：難以使用非揮發(fā)性不穩(wěn)定分析物和LC緩沖液，以及性能不可靠。

　　1976年Finnigan MAT推出傳送帶式LC-MS接口

　　熱噴霧是一個更可靠的軟電離接口，它將色譜柱流出物通過一根非常細(xì)的加熱柱，產(chǎn)生細(xì)液滴噴霧，液滴在大氣壓(API)下通過低電流放電電極電離，形成溶劑離子等離子體。有時會觀察到EI型碎片，但質(zhì)子化或去質(zhì)子化的分子會出現(xiàn)明顯的碎片;非揮發(fā)性分析物的靈敏度較低。1987年，Marvin Vestel[7]創(chuàng)辦Vestec公司推出熱噴霧接口。熱噴霧是20世紀(jì)90年代之前使用最多的LC-MS接口。

　　1987年Vestec推出熱噴霧LC-MS接口

　　諾貝爾獎獲得者、耶魯大學(xué)的約翰·芬恩(John Fenn)開發(fā)了ESI電噴霧[8]，可產(chǎn)生完整、高分子量、多重質(zhì)子化或去質(zhì)子化的離子。Jack Henion及其同事[9]開發(fā)了一種離子噴霧接口，使用霧化氮氣輔助電噴霧操作;SCIEX(隸屬于丹納赫)使用了Henion發(fā)明[10]，1989年推出第一款ESI類型的LC-MS接口。ESI現(xiàn)在是標(biāo)準(zhǔn)的LC-MS接口。

　　1989年SCIEX推出ESI類型的LC-MS接口

　　HPLC還發(fā)展了其它通用探測器。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)和帶電氣溶膠檢測器(CAD)均將LC流動相流出物霧化成液滴，蒸發(fā)后留下非揮發(fā)性分析物的小顆粒。總的來說，2005年ESA Biosciences(先被Dionex收購，現(xiàn)隸屬于賽默飛)推出的CAD檢測器比ELSD更靈敏，并更利于梯度。CAD還可以檢測所有非揮發(fā)性和許多半揮發(fā)性分析物，且響應(yīng)一致。

　　2005年ESA Biosciences推出CAD檢測器

　　超高效時代

　　20世紀(jì)80-90年代的大部分時間里，液相色譜儀大都使用3-3.5μm或5μm顆粒、6000 psi泵和4.6 mm內(nèi)徑的色譜柱。為了滿足快速分析的需要，研究者開發(fā)了亞2μm尺寸的填料，系統(tǒng)再次被推向更高的工作壓力;而且由此產(chǎn)生的粘性加熱效應(yīng)需要更窄內(nèi)徑的色譜柱，因此還需要顯著減少額外的色譜柱體積。2004年，Waters推出Acquity UPLC系統(tǒng)，滿足了21世紀(jì)初新的小顆粒短柱(5-15 cm)和更窄孔徑(內(nèi)徑2.0–2.1mm)的需求。Acquity對現(xiàn)有產(chǎn)品/技術(shù)進行了深思熟慮的組合，從而形成了一個具有合理低額外柱體積的實用系統(tǒng)。這項創(chuàng)新激勵其它十幾家公司推出類似的UHPLC產(chǎn)品。

　　2004年Waters推出Acquity UPLC系統(tǒng)

　　其它創(chuàng)新

　　氣泡讓早期HPLC用戶很煩惱，流動相中的氣泡會損害主泵，檢測器的流動池中也會有氣泡。溶劑需脫氣，首先將溶劑煮沸，再通過精心設(shè)計的儲層將氣體擋在外面。后來SpectraPhysics發(fā)現(xiàn)儲液罐中的氦噴射阻止了空氣在溶劑中的溶解，并允許低壓混合有效地用于HPLC泵。后來，膜脫氣器取代了氦氣噴射，成為今天所有HPLC/UHPLC的一部分。

　　Fittings(色譜接頭)也令人頭疼。通常情況下，過度擰緊配件會導(dǎo)致潛在泄漏，并在重新連接時表現(xiàn)不佳;來自不同公司的Fittings不兼容會產(chǎn)生死體積。Upchurch Scientific發(fā)明了手緊型接頭(Fingertight fittings)，易于重復(fù)使用，并耐受非常高的壓力。

　　創(chuàng)新技術(shù)排名

　　革命性技術(shù)

　　Analytical Scientist曾評出HPLC改變游戲規(guī)則的技術(shù)，分別是：

　　1. 第一臺商用HPLC系統(tǒng)LCS-1000，1967年由Picker Nuclear推出。

　　2. 6通進樣閥，1968年由Valco推出。

　　它取消了隔墊進樣器和停流技術(shù)，采用高壓進樣，改善了保留時間、重現(xiàn)性、自動化和定量性能。

　　3. 模塊化組件，1968年由LDC/Milton Roy推出。

　　獨立的254紫外檢測器、LDC RI檢測器和Milton Roy微型泵等組件迅速應(yīng)用于模塊化色譜儀。第一批儀器是集成的，所有內(nèi)部部件都在一個盒子里。模塊化市場的興起使研究人員能夠獲得最佳組件(例如，泵、進樣器、柱架/柱溫箱、檢測器)。LDC是提供價格合理且功能強大模塊的組件公司。

　　4. Autolab System IV計算積分器，1969年由Autolab推出。

　　第一臺色譜自動積分器用內(nèi)置的機械集成取代了切割稱重、求積儀和記錄儀。該數(shù)據(jù)系統(tǒng)用于GC，并適用于LC。功能包括切線峰檢測、基線校正和峰面積歸一化，并允許使用響應(yīng)因子和內(nèi)標(biāo)。Autolab于1969年被SpectraPhysics收購。

　　4. M-6000液相泵，1972年由Waters推出(與積分器排名并列)。

　　第一臺專為HPLC設(shè)計的泵，主要特點：雙往復(fù)式，不需要脈沖阻尼器，耐壓6000 psi，和一個低容量室。

　　5. 708AL型自動進樣器，1974年由Micromeritics推出。

　　第一臺高效液相色譜自動進樣器，提高了樣品通量和定量能力。后來的產(chǎn)品在該單元上進行了改進。

　　6. 惠普1084型集成型HPLC，1976年由惠普公司推出。

　　具有自動進樣、流量控制、紫外檢測器控制、記錄和報告功能;是第一臺帶有數(shù)字處理器控制的液相色譜儀，帶有內(nèi)置鍵盤和按鈕控制。多年來，它成為質(zhì)量和性能的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

　　7. 8450型二極管陣列檢測器(DAD)，1977年由惠普公司推出。

　　色譜過程中進行動態(tài)紫外-可見光譜分析時，DAD具有優(yōu)異的信噪比性能;與停流光譜掃描相比，生產(chǎn)率提高。其他公司很快也推出了自己的DAD檢測器。

　　8. 傳送帶式LC-MS接口，1976年由Finnigan MAT推出。

　　Finnigan MAT(被賽默飛收購)的McFadden、Schwartz和Bradford研制了傳送帶式接口(moving-belt interface);盡管有一些缺點，但傳送帶接口是真正的色譜接口，是市場上第一個成功的LC-MS接口，是許多方法中優(yōu)選的，直到電噴霧(ESI)出現(xiàn)。

　　9. 帶電氣溶膠探測器(CAD)，2005年由ESA Bioscience推出

　　CAD有時被稱為“窮人的質(zhì)譜儀"，是一種通用檢測器。它的靈敏度比RI檢測器(也是一種通用探測器)高得多，至今仍在廣泛使用。

　　10. Acquity UPLC，2004年由Waters推出

　　為了引入亞2微米顆粒，需要新的高壓儀器。Waters Acquity UPLC系統(tǒng)是第一個設(shè)計用于滿足壓力輸出為12,000 psi的新型小顆粒色譜柱需求的系統(tǒng)。除此之外，Acquity還具有更低的額外柱效應(yīng)和其它改進。

　　雖未上榜，但也極其創(chuàng)新的技術(shù)

　　除了被評選出的改變游戲規(guī)則的技術(shù)，還有以下里程碑，分別是：

　　1967年，Waters推出ALC-100

　　1969年，杜邦推出820型集成系統(tǒng)

　　1973年，Waters專為HPLC研制推出U6K進樣器，旁通的Loop防止柱沖擊，耐壓6000 psi，可變進樣體積。

　　1976年，Rheodyne 推出7125閥，進樣針可注射到閥中心，該技術(shù)后非常流行，并OEM給許多儀器公司。

　　1972年，Cecil儀器公司推出CE212，第一款獨立的可變波長檢測器，帶停流掃描。

　　CE212 可變波長檢測器

　　1970年，瓦里安推出4100/4200注射泵，采用新的輸液泵原理，是第一個用于高壓操作和無脈沖流動的注射泵，此后成功用于8500型HPLC。等度泵(4100型)的流速穩(wěn)定，而梯度泵(4200型)的溶劑體積可壓縮性，影響了流量和溶劑組成的重現(xiàn)性。

　　1976年，Altex推出110泵，是價格合理的獨立往復(fù)泵，通過可變活塞速度優(yōu)化占空比，降低流量脈動。110提供了更流暢的液流、改善的基線和定量性能，并為未來的泵開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

　　1974年，惠普推出HP 3380A數(shù)字積分器，是微處理器控制的積分器，帶有圖表記錄器和字母數(shù)字打印機繪圖儀，一張紙上給出所有計算數(shù)據(jù)。

　　1979年，Nelson Analytical推出用于液相色譜儀的PC軟件。

　　將PC用作峰值積分、定量和儀器控制的驅(qū)動程序，并OEM給許多制造商。在Nelson SW之后，幾乎所有儀器都使用PC來控制硬件和處理數(shù)據(jù);獨立計算集成商迅速死亡(該公司于1989年被PerkinElmer收購)。

　　1977年，瓦里安推出LC 5000液相色譜儀。

　　LC 5000采用一種全新的集成系統(tǒng)方法。該泵設(shè)計用于在一個泵頭中低壓混合三種溶劑，系統(tǒng)有自己的CRT顯示器和鍵盤，可以并排安裝檢測器，除數(shù)據(jù)系統(tǒng)(外部)外，LC的各個方面都由微處理器處理。LC 5000為后來大多數(shù)液相色譜儀提供了遵循的平臺。

　　1975年，戴安Dionex推出Model 10離子色譜儀。

　　Durrum instruments從陶氏化學(xué)獲得了授權(quán)，并成立了一個單獨的部門(Dionex)開發(fā)一種產(chǎn)品，通過使用抑制柱的電導(dǎo)檢測來分離離子化合物，以去除流動相中的鹽并降低背景電導(dǎo)率。Dionex成為了這項技術(shù)的被認(rèn)可品牌，至今仍保持第一(后被賽默飛收購)。

　　1987年，Vestec公司推出熱噴霧LC-MS接口。

　　EI型碎裂有時被認(rèn)為是質(zhì)子化或去質(zhì)子化分子的顯著碎裂。在有限的LC條件范圍內(nèi)，非揮發(fā)性分析物的靈敏度較低。直到20世紀(jì)90年代，熱噴霧成為主要的LC/MS接口，主要是由于其觀察到EI型碎裂。

　　1989年，SCIEX推出電噴霧(離子噴霧)LC-MS接口。耶魯大學(xué)的John Fenn開發(fā)了電噴霧(ESI)源，可產(chǎn)生完整、高分子量、多重質(zhì)子化或去質(zhì)子化的離子，他因此獲得2002年Nobel化學(xué)獎，其獲獎演講題為《當(dāng)大象飛翔》。Fenn觀察到ESI靈敏度與分析物濃度有關(guān)，毛細(xì)管柱的洗脫峰明顯比大口徑柱的洗脫峰更尖銳，從而在較低的進樣量下大大提高了靈敏度。現(xiàn)在，ESI是標(biāo)準(zhǔn)LC-MS接口。Henion等人開發(fā)了離子噴霧接口，使用霧化氮氣輔助電噴霧操作;SCIEX使用了Henion授權(quán)，是第一個銷售該產(chǎn)品的公司。

　　展望未來的50年

　　未來HPLC發(fā)展的幾大趨勢。

　　小型化

　　短期內(nèi)希望出現(xiàn)小型化、易于更換的單片或立柱集成到手持式或口袋大小的電池供電LC系統(tǒng)中，無需端部接頭(fitting)，不增加死體積。從長遠(yuǎn)來看，將出現(xiàn)小型化的個人分離系統(tǒng)，集成組件和靈敏、選擇性的通用檢測，能夠?qū)崟r分析個人的健康狀況。

　　LC與腕表配置的離子遷移譜儀耦合，腕表周長提供漂移管的尺寸。應(yīng)用包括：健康檢查或銷售網(wǎng)點的新鮮度指標(biāo)和鑒別。

　　智能化

　　智能、自動化儀器，只需一個按鈕就可執(zhí)行分析;非專業(yè)用戶無需更換色譜柱、開發(fā)方法或進行定量分析。就像自動駕駛汽車一樣，將人工智能結(jié)合于液相色譜中。

　　專用化

　　集成樣品制備的專用分析儀，樣品可以放置在卡片或手指上，插入儀器，在不到1分鐘內(nèi)完成完整的分析(例如藥物篩選)。此外，廉價的連續(xù)/定期監(jiān)測LC設(shè)備，能夠在故障發(fā)生之前預(yù)測故障。

　　多維液相

　　希望短期內(nèi)出現(xiàn)實用的多維液相色譜系統(tǒng)，解決目前的定量問題。從長遠(yuǎn)來看，智能、自動儀器不需要非熟練用戶更換色譜柱、開發(fā)方法或進行定量分析。

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