EPI400 Electro
EPI400 Electroporation-Competent Cell




     EPI400感受態(tài)細(xì)胞基因型：
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697  galU

galK  λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfr
EPI400感受態(tài)細(xì)胞簡(jiǎn)要說明：
EPI400 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。--

該菌株來源于 EC100 菌株，將 EC100 核基因中控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的 pcnB 基因刪除后引入一個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 pcnB 基因，即是 EPI400 菌株。--EPI400 菌株可以降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)，特別適合于各種不穩(wěn)定 DNA 或毒性基因的克隆，在加入誘導(dǎo)劑 CopyCutter Induction Solution 后又可以提高質(zhì)粒產(chǎn)量到正常狀態(tài)。[mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使 EPI400 菌株適合 于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的 DNA。recA1 和 endA1 的突變有利于插入 DNA 的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒 DNA 的 提取。lacZΔM15 標(biāo)記的存在使 DH10B 可用于藍(lán)白斑篩選，tonA 賦予其抗噬菌體 T1 和 T5 的能力，rpsL 賦予其鏈 霉素抗性。--
--EPI400 電擊感受態(tài)細(xì)胞適用于不穩(wěn)定 DNA 或毒性基因的克隆，經(jīng)特殊工藝制作，pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)

化效率>1010 cfu/μg DNA。

     EPI400感受態(tài)細(xì)胞操作說明：

1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5 分鐘，待其瀝干水分，正置 5 分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，

待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面 0.5 cm 以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5 分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的 EPI400 電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中 5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手 EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。--
A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對(duì)照質(zhì)粒  pUC19；--

B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，請(qǐng)用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸，DNA 濃度 不超過 100ng/μl，體積不超過 5μl/50μl 感受態(tài)。--
3. 用 200 μl 槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。--

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推 薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。--
5. 2 分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl 不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用 1ml 槍吹吸電擊 杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管（BD Falcon50ml 錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加 S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。 37℃，225 rpm 復(fù)蘇 60 分鐘。--
6. 5000rpm 離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應(yīng)抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板 請(qǐng)選用直徑 15cm 培養(yǎng)皿 2-5 個(gè)）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng) 13-17 小時(shí)。--
     EPI400感受態(tài)細(xì)胞注意事項(xiàng)：

1. 加入 DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10。--

2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。--

3. 當(dāng) DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。--

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和 DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。--

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)

數(shù)量級(jí)。--

6. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀 DNA 后用適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn) 物，保證 DNA 濃度不超過 100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。 

7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)不可用孔徑過小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應(yīng)剪去槍頭尖 0.6cm) 避免用 力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。      

 8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。--