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安捷倫6470液質聯用儀檢測涼皮中的米酵菌酸
閱讀：85 發布時間：2024-11-20摘要本文介紹了使用 QuEChERS 快速基質分散固相萃取結合 Agilent 1290 Infinity II-6470B三重四極桿液質聯用系統 (LC-MS/MS) 檢測涼皮中米酵菌酸的分析方法。該方法使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，使米酵菌酸獲得了良好的峰形并與基質組分有效分離；在樣品前處理中，使用 5% 甲酸乙腈提取，針對樣品中是否含油脂分別采用直接提取和 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 試劑盒凈化，操作過程簡便、快速；方法檢出限和定量限分別為 5 μg/kg 和 10 μg/kg，靈敏度出色；在 2–100 ng/mL 濃度范圍內，米酵菌酸的線性相關系數為 0.9998，表現出良好的線性；在 10–100 μg/kg 的加標濃度下，通過兩種樣品前處理方法所得到的涼皮中目標化合物的平均加標回收率和相對標準偏差分別為 83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，表明該方法具有出色的準確度和精密度。該方法適用于定量測定涼皮中的米酵菌酸。
前言米酵菌酸 (Bongkrekic Acid, BA) 是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產生的一種毒素。被該毒素污染的食物可能引起人或動物中毒，重者可致死亡[1]。米酵菌酸熱穩定性好，即使烹飪也不易分解，是發酵玉米面制品、變質鮮銀耳及其他變質淀粉類制品引起食物中毒的主要原因。誤食后可造成多臟器損害、急性中毒甚至死亡，致死率高達 30%–50%，對人們的身體健康和生命安全有巨大的潛在威脅[2]。2023 年 7 月 14 日河南永城“毒涼皮事件"被證實是變質涼皮中米酵菌酸引起的中毒，由此引發對涼皮等濕米制品中米酵菌酸檢測的關注。關于食品中米酵菌酸類化合物的檢測，GB/T 5009.189-2016[3] 使用 LC-DAD 作為分析系統；用 80 mL 氨化甲醇進行提取，并用陰離子交換固相萃取柱進行凈化，實驗過程溶劑消耗量大、濃縮倍數高且效率較低。
本實驗使用高靈敏度的 Agilent 6470 三重四極桿液質聯用系統，基于米酵菌酸（化學結構式見圖 1）的結構特點，含有 3 個典型羧基官能團，呈弱酸性，因此酸性條件下能有效避免米酵菌酸的解離，增強其反相保留并改善質譜響應；結構中含有長鏈不飽和烷烴結構，脂溶性較強，可采用反相色譜保留機理進行分析。另外，考慮到涼皮會在表面上涂抹植物油以防止在儲存和運輸過程中發生粘連，因此在樣品前處理中通過鹽析除水溶性淀粉和去除脂肪。本應用使用 5% 酸化乙腈提取后進行鹽析萃取，并針對涂抹植物油的涼皮樣品，采用含有 C18 吸附劑的 Bond ElutQuEChERS 快速基質分散固相萃取以去除油脂。獲得了理想的方法靈敏度、準確度和精密度。
實驗部分試劑和樣品實驗用乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司；實驗用水為娃哈哈純凈水；米酵菌酸標準品購于曼哈格公司(BePure)，以甲醇為溶劑，濃度為 100 µg/mL；涼皮樣品為市售產品。標準品制備取適量米酵菌酸標準品，用乙腈配制成濃度為 1 μg/mL 的標準工作液，逐級稀釋后備用。
基質校準標樣的配制：準確移取適量的上述標準工作液，用經過樣品前處理后的基質空白液進行稀釋，分別得到濃度為 2、5、10、20、50、100 ng/mL 的校準標樣。臨用現配。樣品前處理稱取涼皮樣品，加入水和陶瓷均質子，渦旋混勻后用 5% 甲酸乙腈提取；鹽析分層后分別直接過膜進樣和經 QuEChERS 分散式SPE 試劑盒凈化后進樣，使用 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離，經 LC-MS/MS 進行檢測。如圖 1 所示為樣品前處理操作流程。
檢出限和定量限通過空白基質加標回收實驗來確定方法檢出限和定量限。當加標濃度水平為 5 μg/kg 時仍可定性檢出米酵菌酸，且信噪比 (S/N)大于 3，由此確定方法檢出限為 5 μg/kg；當加標濃度為 10 μg/kg時，S/N 大于 10，且回收率和精密度滿足國家標準相關要求，由此確定方法定量限為 10 μg/kg，優于 GB/T 5009.189-2016方法的定量限 (15 μg/kg)。
加標回收率和精密度選擇涼皮作為檢測基質，分別將加標濃度設置為 10、20、100 μg/kg，且每個加標濃度設 6 個平行樣，通過基質標樣單點校正進行定量。所得加標回收率和相對標準偏差 (RSD) 結果見表 2。從表中可以看出，未經脂肪去除凈化時，涼皮基質中米酵菌酸的平均加標回收率和相對標準偏差分別為 98.8%–102.4%和 1.7%–3.5%；經過 QuEChERS 分散式 SPE 凈化處理后，涼皮基質中米酵菌酸的平均加標回收率和相對標準偏差分別為83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均有良好的準確度和精密度。通過兩種處理方式所得到的涼皮基質空白、標樣和加標樣品疊加色譜圖見圖 4。由圖中可以看出，經過 QuEChERS 基質分散凈化包處理后，獲得了更出色的凈化效果，空白基線噪音明顯降低。
結論本應用采用高靈敏度的 Agilent 6470 三重四極桿液質聯用系統(LC-MS/MS)，通過 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱使米酵菌酸獲得了良好的峰形并與其他基質組分得到有效分離。該方法針對未加油的涼皮或其他不含油的食品基質，使用 5% 甲酸乙腈直接提取鹽析萃取、過膜后上機檢測；對于含有一定油脂的樣品，在提取后使用 Agilent Bond Elut QuEChERS 分散式 SPE 試劑盒實現快速、高效的凈化，以減少對儀器的污染并延長色譜柱使用壽命。與現行國家標準方法中的樣品前處理過程相比，該方法更加簡便、快速。在 2–100 ng/mL 的濃度范圍內，米酵菌酸線性相關系數為 0.9998，表現出良好的線性；方法檢出限為 5 μg/kg，定量限為 10 μg/kg，具有出色的靈敏度；在 10、20、100 μg/kg 的加標濃度下，直接提取與經過 QuEChERS 分散式 SPE 凈化處理時，涼皮基質中米酵菌酸的平均加標回收率和相對標準偏差分別為83.3%–103.3% 和 0.6%–4.3%，均表現出良好的準確度和精密度。該方法適用于定量測定涼皮中的米酵菌酸。