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高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）分析原理：
磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測試劑盒用于測量在 Thr202/Tyr204 位點磷酸化的 ERK。與蛋白質印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉膜。磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測使用兩種標記抗體：一種帶有供體熒光團，另一種帶有受體。第一種抗體因其對蛋白質上磷酸化基序的特異性結合而被選擇，第二種抗體因其能夠識別不依賴于其磷酸化狀態的蛋白質的能力而被選擇。蛋白質磷酸化使得涉及兩種標記抗體的免疫復合物形成，并使供體熒光團靠近受體，從而產生熒光共振能量轉移（FRET）信號。其強度與樣品中磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并提供了一種在無需洗滌的檢測形式下評估蛋白質磷酸化狀態的方法。

高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）雙板檢測方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養細胞，然后裂解，再將裂解液轉移到 384 孔低體積檢測板中，然后加入磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）HTRF 檢測試劑。該方案能夠監測細胞的活力和融合度。

高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）單板檢測方案：
使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）可以在用于培養、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這種為高通量篩選設計的方案能夠實現微型化，同時保持穩健的 HTRF 質量。

分析驗證：

與蛋白質印跡法相比，高級磷酸化 ERK 具有靈敏度。

在 HEK293 細胞培養 48 小時后，用 50nM EGF 刺激 5 分鐘。去除培養基并裂解后，收集細胞裂解液并離心 10 分鐘。進行系列稀釋，并通過蛋白質印跡法和 HTRF 高級磷酸化 ERK 并行分析。使用 HTRF 高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）時，僅需 300 個細胞即可檢測到最小信號，而蛋白質印跡法則需要 10,000 個細胞才能產生信號。HTRF 高級磷酸化 ERK 檢測至少比蛋白質印跡法靈敏 30 倍，并且顯示出最佳的相關性。

無需刺激即可對抑制劑的基礎磷酸化 ERK 進行劑量反應。

高級磷酸化 ERK 能夠研究 MAPK 通路抑制劑化合物在基礎激活水平上的作用，無需通路刺激。由于其高交叉反應性，高級磷酸化 ERK 與許多不同的模型物種高度兼容：人、小鼠、大鼠、狗、猴、倉鼠、貂、牛、豬、果蠅和斑馬魚。所有實驗均使用貼壁細胞的雙板檢測方案進行。接種一天后，所有細胞系在 37°C、5% CO?下用相應的抑制劑處理 30 分鐘。

磷酸化 ERK 在糖尿病模型和患者血細胞中的調節

高級磷酸化 ERK 檢測試劑盒非常適合監測胰腺 β 細胞系或患者外周血單個核細胞（PBMC）中的激動劑刺激。實驗在兩種胰腺 β 細胞系 Ins-1E 和 Min6 上進行。使用雙板檢測方案。兩種細胞系均以 70,000 個細胞 / 孔的密度接種 4 天。細胞洗滌后，用不含葡萄糖的 Krebs Ringer 緩沖液孵育。饑餓 2 小時后，用葡萄糖刺激細胞。將 PBMC 以 100,000 個細胞 / 孔的密度分配，然后在 37°C、5% CO?下用佛波酯（PMA）刺激 30 分鐘。

腫瘤異種移植中靈敏的磷酸化 ERK 檢測。

從裸鼠中切除 BxPC-3 胰腺腫瘤異種移植組織，研磨并裂解。離心后，收集可溶性部分并進行系列稀釋，然后用 HTRF 高級磷酸化 ERK 試劑盒試劑進行檢測。

優化用于磷酸化 ERK 檢測的細胞密度。

由于高級磷酸化 ERK 的高靈敏度，當預期 ERK 磷酸化水平較高時，建議使用標準細胞系的低細胞密度，以確保在試劑盒的線性范圍內操作并實現最佳的信號 / 背景比（S/B）。使用貼壁細胞的雙板檢測方案，在 HEK293 細胞上用 EGFR 激動劑 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制劑 L779 - 450 進行劑量反應實驗。細胞以 25,000、50,000 或 100,000 個細胞 / 孔的密度在 37°C、5% CO?下接種 24 小時。

Gαq/i 偶聯受體激活。

使用磷酸化 ERK 細胞檢測的雙板檢測方案，在 CHO - CCR5（25,000 個細胞）上用 Rantes 和 MIP - I? 激活 10 分鐘獲得的結果。

篩選魯棒性。

在室溫下用卡巴刺激 CHO - M1（5,000 個細胞 / 孔 - 384 孔小體積板）10 分鐘。在五十次重復實驗中，計算未刺激細胞（基礎水平）和兩個選定的卡巴濃度（1.3μM 和 4μM，分別對應于 EC80 和 EC100）之間的 Z' 值。使用磷酸化 ERK 試劑盒的單板檢測方案在來自 CyBio™的機器人系統（配備 384/25μL 移液頭的 CyBivario）上進行檢測。結果在 PHERAStar Plus（BMG Labtech）上讀取。

總 ERK1/2 檢測以控制 ERK1/2 的磷酸化。

使用磷酸化 ERK1/2 和總 ERK1/2 檢測的雙板檢測方案，用 EGF 激活 A431 細胞（100,000 個細胞 / 孔）10 分鐘。正如預期的那樣，結果顯示在 EGF 刺激下 ERK1/2 磷酸化呈劑量反應性增加，而 ERK1/2 表達水平保持恒定。

簡化的通路：

MAPK/ERK 細胞信號通路：

MAPK/ERK 信號級聯由參與生長和分化的多種受體激活。核心信號轉導級聯引發眾多細胞過程的調節，包括粘附、遷移、凋亡、分化和代謝。MEK1/2 在 Tyr204 和 Thr202 位點催化 ERK1/2 的磷酸化。作為響應，ERK 磷酸化數百種細胞質和核底物。MAPK 信號的廣泛復雜性和多樣性使 ERK 成為生物學中的關鍵調節因子和主要信號節點。

ERK 在 GPCR 信號通路中的作用：
ERK 調節在 GPCR 信號通路中起著重要作用，因此是一個重要的可測量的 GPCR 讀出指標。GPCR 通過 G 蛋白作用調節廣泛的細胞功能。在刺激下，這些受體激活效應器如腺苷酸環化酶和磷脂酶 C，這不僅影響細胞內第二信使如 cAMP 和 Ca2?的濃度，還介導 ERK1/2 磷酸化。GPCR 也已被證明以不依賴 G 蛋白但依賴 β-arrestin 的方式介導 ERK1/2 激活。