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細胞因子釋放綜合征（Cytokine release syndrome, CRS）一詞最早出現(xiàn)在90年代，當時抗T細胞抗體OKT3作為免疫抑制劑被引入臨床，用于后的治療。現(xiàn)在也被稱為細胞因子風(fēng)暴（Cytokine storms)。它是由免疫細胞過度活化引起的一種全身性的炎癥反應(yīng),可由多種因素引發(fā)，例如感染，藥物等。

為什么要進行細胞因子釋放試驗？

TGN1412是以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和白血病為主要目標的新型藥物，2006年開展臨床試驗，6名健康志愿者在輸注TGN1412后，出現(xiàn)了罕見的病變反應(yīng)，產(chǎn)生了嚴重的細胞因子釋放綜合征并伴有多器官功能衰竭。這一事件也使得建立可靠的體內(nèi)動物模型和體外細胞因子釋放實驗來預(yù)測細胞因子綜合征的發(fā)生，成為臨床前安全性評價的研究熱點。免疫調(diào)節(jié)類的藥物或療法，例如CAR-T，含有CD3靶點的雙抗，屬于細胞因子釋放綜合癥的高風(fēng)險類產(chǎn)品。對于具有潛在風(fēng)險的藥物，在IND申報前，根據(jù)CDE在2020年發(fā)布的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，除了需要在常規(guī)的動物體內(nèi)毒性試驗中進行細胞因子相關(guān)檢測外，應(yīng)進行體外細胞因子釋放試驗[9]。

如何設(shè)計細胞因子釋放試驗？

由于種屬的差異，動物模型可能無法模仿人體免疫激發(fā)的過程，因此當體內(nèi)結(jié)果為陰性時，仍需設(shè)計合適的體外因子釋放試驗以揭示潛在的臨床安全風(fēng)險。一般采用人全血或人外周血單個核細胞（PBMC）評價細胞因子活化和細胞因子釋放。一般來說，相比于全血，PBMC對免疫調(diào)節(jié)類的產(chǎn)品更為敏感，更易得到陽性的結(jié)果。但是PBMC并不能很好的模擬真實的體內(nèi)環(huán)境，也可以考慮采用稀釋后的全血，例如采用20%（v/v）或10%（v/v）等體積比的全血。一般而言，需要使用至少3名健康受試者的全血或PBMC來進行實驗。若采用全血，不同受試者之間的變異程度可能更大，也可以考慮增加受試者的數(shù)量。一些靶點只會在特定的疾病群體中高度表達，在這種情況下，也可以使用特定疾病群體的全血或者PBMC來進行實驗。

圖1. TGN1412體外細胞因子釋放試驗的6種模型[1]

實驗設(shè)計時，需要考慮固相法或液相法兩種孵育體系，以盡可能模擬體內(nèi)抗體呈遞給T細胞的方式。NIBSC設(shè)計了6種基于PBMC的TGN1412的細胞因子釋放試驗實驗?zāi)Ｐ蚚1]。方案1和2均為液相法，不同的是方案2中還引入了Anti-Fc抗體;方案3和方案4均為固相法，分別用濕法（Wet-coated）和干法(Air-dried)將TGN1412包被到細胞培養(yǎng)板上。方案5中將抗Fc的抗體包被到孔板后再加入TGN1412，整合了方案3和4中的方法；方案6中則引入了人內(nèi)皮細胞，以模擬人體內(nèi)的TGN1412和內(nèi)皮細胞的相互作用。方案1和2和TGN1412臨床前安全性評價中使用的方法類似，不能刺激細胞釋放大量的細胞因子。當方案3不能刺激細胞釋放細胞因子時，可以考慮方案4,5和6，這些方案中至少有一種能將TGN1412呈遞給T細胞以提供有效的體外刺激。鑒于藥物誘導(dǎo)細胞因子釋放的機理和靶點的復(fù)雜性，還需具體情況具體分析，選擇最合適的體外刺激模型。

檢測哪些細胞因子？

CRS的病理生理機制尚不清楚。CRS通常是由于藥物和細胞受體結(jié)合引起的靶效應(yīng)，其抗原隨后激活旁觀者免疫細胞和非免疫細胞，如內(nèi)皮細胞。CRS可以通過連續(xù)釋放干擾素γ (IFN-γ)或腫瘤壞死因子α (TNF-α)等細胞因子直接裂解靶細胞或通過治療性刺激激活T細胞并隨后釋放細胞因子來誘導(dǎo)。由于先天免疫細胞如巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的激活，這些細胞因子觸發(fā)連鎖反應(yīng)，進一步釋放細胞因子。IL-6，IL-10和IFN-γ是發(fā)生CRS的患者血清中持續(xù)升高的主要因子。CRS是由活化的T細胞或腫瘤細胞自身大量釋放IFN-γ觸發(fā)的。IFN-γ會引起發(fā)燒、寒戰(zhàn)、頭痛、頭暈和疲勞，并誘導(dǎo)其他免疫細胞的活化，尤其是巨噬細胞[2]。活化的巨噬細胞會進一步分泌大量的IL-6、TNF-α和IL-10。TNF-α?xí)鸷虸FN-γ類似的癥狀。除了上述的因子外，多項研究表明[3][7][8]，細胞活化也會引起IL-2的大量釋放，高濃度的IL-2和IFN-γ已被認為是類似于TGN1412反應(yīng)的標志[4]。IL-6則會引起嚴重的CRS特征性癥狀，如即血管滲漏，激活補體和凝血級聯(lián)誘導(dǎo)彌散性血管內(nèi)凝血等[2]。細胞因子的檢測項目應(yīng)與受試藥物臨床安全性考慮密切相關(guān)，一般情況下，觀察指標包括但不限于IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。除了上述的因子，一些藥物可能也會引起其他相關(guān)的細胞因子的釋放，例如IL-1b, IL-5, IL-8,IL-12,和IL-17等。因此細胞因子的選擇需要根據(jù)藥物靶點、靶向細胞群以及藥物的作用機制等進行特異性的調(diào)整。

圖2.細胞因子綜合征的誘因和發(fā)生機制[2]

如何選擇陽性和陰性質(zhì)控？

由于細胞因子釋放試驗的設(shè)計多樣，不同的藥物在不同的體外模型中會有不同的結(jié)果，因此選擇合適的陰性對照和陽性對照。陰性對照有多種選擇，例如PBS，陰性對照單抗（例如Avastin），Isotype，或者用于稀釋全血的細胞培養(yǎng)基。在細胞共培養(yǎng)模型中，陰性對照可能還需要包括在沒有藥物刺激的情況下PBMC和靶細胞共培養(yǎng)以及在有藥物的情況下PBMC和非靶細胞的共培養(yǎng)。陽性對照一般可以選擇OKT3（anti-CD3）,TGN1412(anti-CD28)，LPS，PHA，PMA和離子霉素等。除此之外，也可以根據(jù)體外模型增加相應(yīng)的對照樣品。