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   聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction簡稱PCR）基因擴增技術又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點，已在病原微生物學領域中顯示出巨大的應用價值和廣闊的發展前景。

    PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應用于人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產前診斷。自85年第1次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫判定和考古研究等多領域、并發揮了越來越大的作用。因而發明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學獎。
為了使PCR技術在臨床上迅速得以普及，我們對該技術的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術變得簡單、微量化、不易發生污染，從而使PCR技術常規化成為可能。

一、PCR技術的特點:
1、特異性高
　　報導的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續反應，顯著地提高PCR產物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發現部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
2、高度敏感
　　理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上，實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。
3、快速及無放射性
　　一般在2小時內約可完成30次以上的循環擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應起始物，可直接用臨床標本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發、細胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。
4、簡便
　　擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應酶切位點的載體中。
5、可擴增RNA或cDNA
　　先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉錄酶將mRNA轉變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。

二、PCR擴增產物的分析法
    PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙xi酰胺凝膠電泳檢測，以前者常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。
　　電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結果并拍照。
　　凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
2、點雜交
　　當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩定和放射性危害，不能常規用于臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和di高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
　　該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規應用的ELISA,適于臨床實驗室常規應用。
4、PCR-ELISA法
　　本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。

三、PCR實驗中常見問題對策
　　所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。
1、假陰性
　　出現假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。所以在實驗中出現假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、 lv仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要 保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
2、假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。