化學(xué)分析| 虛擬校正實現(xiàn)異質(zhì)性生物組織中待測物準(zhǔn)確定量質(zhì)譜成像

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Analytical Chemistry| 虛擬校正實現(xiàn)異質(zhì)性生物組織中待測物準(zhǔn)確定量質(zhì)譜成像

質(zhì)譜成像

文獻(xiàn)精讀

再帕爾·阿不力孜科研團(tuán)隊第39期

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所

天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實驗室

文獻(xiàn)整理：王相宜指導(dǎo)教師：賀玖明

2019年1月，本課題組在Anal.Chem.上發(fā)表了一篇題為“Virtual Calibration Quantitative Mass Spectrometry Imaging for Accurately Mapping Analytes across Heterogenous Biotissue”的研究論文，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以內(nèi)源性代謝物為天然內(nèi)標(biāo)，建立了虛擬校正定量質(zhì)譜成像分析新方法，解決了生物組織中難以均勻添加內(nèi)標(biāo)化合物的技術(shù)難題，實現(xiàn)了整體動物體內(nèi)或異質(zhì)性生物組織中藥物（或內(nèi)源性代謝生物標(biāo)志物）的準(zhǔn)確定量成像分析。

背景介紹

生物體各器官以及亞器官區(qū)域因其生化微環(huán)境不同使得藥物離子響應(yīng)有差異，尤其是異質(zhì)性生物組織（腎、腦、腫瘤等）的基質(zhì)效應(yīng)在組織微區(qū)中差別較大。質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)作為新型分子成像技術(shù)，可同時獲得藥物和代謝物的類型、含量和空間分布信息，而基質(zhì)效應(yīng)限制了定量質(zhì)譜成像（QMSI）的發(fā)展。添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)是校正基質(zhì)效應(yīng)的常用方法，但該方法成本高、樣品前處理繁瑣、內(nèi)標(biāo)化合物均勻添加困難。本研究以內(nèi)源性代謝物為天然內(nèi)標(biāo)，建立了虛擬校正定量質(zhì)譜成像（VC-QMSI）分析新方法，校正每個像素點(diǎn)的相對基質(zhì)效應(yīng)，實現(xiàn)準(zhǔn)確定量成像分析。

VC-QMSI策略

圖1 虛擬校正定量質(zhì)譜成像分析方法

1.采用AFADESI-MSI技術(shù)實現(xiàn)生物組織中藥物和大量內(nèi)源性代謝物同時成像檢測。

2.加入相同含量藥物至不同模擬組織中，選取與藥物離子強(qiáng)度變化相關(guān)性較高的前10個內(nèi)源性代謝物離子，作為天然內(nèi)標(biāo)；以每個像素點(diǎn)中天然內(nèi)標(biāo)相對強(qiáng)度為輸入變量X_i，對應(yīng)像素中藥物相對離子強(qiáng)度為輸出變量Y，用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法建立回歸模型f_r=F(X_i)。

3.加入系列稀釋濃度藥物至模擬組織建立標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，輸入相應(yīng)的Xi到回歸模型f_r=F(X_i)中，計算虛擬校正因子f_r，并對藥物離子相對強(qiáng)度I_i進(jìn)行校正I_i′=I_i/f_r，建立I_i′與藥物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.檢測并計算得到的待測組織或整體動物切片中各像素點(diǎn)的校正藥物離子相對強(qiáng)度I_i′，將I_i′代入標(biāo)曲中得到對應(yīng)的含量，實現(xiàn)藥物準(zhǔn)確定量成像。

5.t-SNE-Kmeans聚類分析整體動物所有像素點(diǎn)，實現(xiàn)自動空間識別。

6.完成藥物體內(nèi)分布準(zhǔn)確定量分析，進(jìn)行藥代動力學(xué)性質(zhì)評價。

實驗設(shè)計

1.比較不同算法建立的回歸模型，獲得更佳算法。

2.對高度異質(zhì)性組織微區(qū)進(jìn)行虛擬校正。

3.用抗腫瘤藥物甲氨蝶呤MTX和其氘代物MTX-D₃以及紫杉醇衍生物PTXCH驗證VC-QMSI。

4.用三種不同特征離子集合進(jìn)行Kmeans聚類分析，比較聚類和空間識別結(jié)果。

5.VC-QMSI在抗腫瘤候選藥物L(fēng)XY6006（LXY）和PTXCH藥代動力學(xué)評價上的應(yīng)用。

實驗結(jié)果

1.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法準(zhǔn)確性更好

比較四種不同算法（主成分回歸PCR、索套回歸LR、支持向量回歸SVM、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ANN，圖2A）建立的回歸模型，各模擬器官相對基質(zhì)效應(yīng)的計算結(jié)果顯示，LR和ANN的擬合效果更好（圖2B），平均相對誤差約小于10%，相關(guān)系數(shù)大于0.99；用f_r逐像素校正藥物離子強(qiáng)度后，各器官間平均藥物相對離子強(qiáng)度的RSD小于15%，且整體動物切片f_r成像圖的區(qū)域差異明顯（圖2C）。ANN模型具有更高的準(zhǔn)確性，后續(xù)實驗中都采用ANN回歸模型。

圖2 不同回歸模型的基質(zhì)效應(yīng)校正因子

2. 亞器官水平的虛擬校正

對高度異質(zhì)性組織（腎、腦、腫瘤）中的藥物進(jìn)行VC-QMSI，組織切片相對校正因子RCF的可視化結(jié)果（圖3A-C）和統(tǒng)計分析（圖3D-F）顯示，RCF預(yù)測值在組織亞器官區(qū)域有差異，校正后的腎髓質(zhì)和腎皮質(zhì)的標(biāo)曲線性更好且斜率更接近（圖3I），證明VC-QMSI可以校正亞器官區(qū)域的待測物離子強(qiáng)度，消除組織特異性基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖3 高度異質(zhì)性組織亞器官水平RCF預(yù)測

3. VC-QMSI驗證

加入相同含量MTX和MTX-D₃至不同模擬組織中，虛擬校正后各組織間和像素間的MTX離子強(qiáng)度差異RSD均下降；加入系列稀釋濃度MTX和MTX-D3至不同模型樣本（S₁-S₆）中，結(jié)果表明虛擬校正（VC）和同位素校正（IC）的標(biāo)曲線性一致，r=0.9994（圖4B-C）。使用VC-QMSI方法，終得到MTX（圖5B）和其代謝產(chǎn)物（圖5C）在整體動物切片中的定量成像圖。以上結(jié)果說明VC具有與IC相同的效果。以PTXCH為待測物，加入系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液至不同模擬組織中，虛擬校正后的標(biāo)曲線性更好，并且成功用于肌肉和腫瘤組織的校正和定量（圖6）。

圖4 MTX標(biāo)準(zhǔn)曲線（A：未校正）

圖5 MTX和其代謝產(chǎn)物7-羥基-MTX整體動物定量質(zhì)譜成像結(jié)果（A:RCF成像）

圖6 添加PTXCH組織的線性擬合和外推結(jié)果

4.t-SNE-Kmeans聚類分析空間識別準(zhǔn)確

本研究建立了無監(jiān)督的、基于代謝組學(xué)特征的區(qū)域聚類模型，實現(xiàn)更準(zhǔn)確的自動空間識別。分別使用110個內(nèi)源性代謝物離子、3個PCA成分和3個t-SNE成分作為輸入變量，三者Kmeans聚類分析結(jié)果顯示，t-SNE-Kmeans聚類分析方法將整體動物切片所有像素分為14個集群，且集群重疊少（圖7A）。將像素按照位置索引重構(gòu)整體動物圖像（圖7D），發(fā)現(xiàn)絕大部分同一組織學(xué)區(qū)域的像素點(diǎn)屬于同一集群。該方法可以提高定量藥物分布的準(zhǔn)確性，避免基于光學(xué)圖像指導(dǎo)的人工組織區(qū)域選擇造成的誤差。

圖7 比較不同方法的像素聚類和空間分割結(jié)果

5.藥代動力學(xué)性質(zhì)評價

LXY在整體動物上的定量分布如圖8所示，模擬心和肺中藥物響應(yīng)較低，而在校正后離子化效率和其他器官達(dá)到同一水平。將VC-QMSI和TEC（組織消光系數(shù)）-QMSI的定量結(jié)果進(jìn)行比較，相對誤差≤±35%，兩者呈線性相關(guān)r=0.9855，說明VC-QMSI可以提供藥物準(zhǔn)確定量分布情況，并且可用于未知組織的定量分析。

VC-QMSI也可應(yīng)用于臨床前藥物研究，例如定量計算LXY不同劑型和給藥方式的生物利用度。此外，我們通過可視化藥物在整體動物切片中的分布情況，直觀比較抗腫瘤候選藥物L(fēng)XY和PTXCH以及陽性藥PTX的腫瘤靶向效率（圖9），推測PTXCH有更好的靶向治療效果和更低的不良反應(yīng)。

圖8 LXY定量質(zhì)譜成像結(jié)果

圖9 整體動物中不同抗腫瘤藥物的時空變化

總結(jié)

VC-QMSI采用AFADESI-MSI技術(shù)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以內(nèi)源性代謝物為天然內(nèi)標(biāo)，建立待測物濃度與內(nèi)源性代謝物之間的相對基質(zhì)效應(yīng)預(yù)測回歸模型，實現(xiàn)每個像素點(diǎn)的基質(zhì)效應(yīng)校正，從而達(dá)到準(zhǔn)確定量質(zhì)譜成像分析。該方法解決了生物組織中難以均勻添加內(nèi)標(biāo)化合物的難題，無需高成本的同位素內(nèi)標(biāo)制備和繁瑣的樣品前處理，且實現(xiàn)了整體動物或異質(zhì)性組織微區(qū)中藥物或生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量成像分析，為新藥研發(fā)或疾病診斷提供了更加準(zhǔn)確可靠的可視化研究工具。

參考文獻(xiàn)：Song X，He J，Pang X，et al.Virtual Calibration Quantitative Mass Spectrometry Imaging for Accurately Mapping Analytes Across Heterogenous Bio-tissue[J]. Analytical chemistry, 2019，91(4)：2838-2846

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