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乙酰膽堿受體抗體檢測界值的優(yōu)化及對重癥肌無力診斷效能的驗證
閱讀：1125 發(fā)布時間：2022-7-4
乙酰膽堿受體抗體檢測界值的優(yōu)化及對重癥肌無力診斷效能的驗證
Optimization of the cut-offs in acetylcholine receptor antibodies and diagnostic performance in myasthenia gravis patients
李海峰，首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經內科；
邵凱，山東大學齊魯醫(yī)院（青島）醫(yī)學實驗中心；
郝洪軍，北京大學第一醫(yī)院神經免疫實驗室
乙酰膽堿受體抗體（AChRAb）是重癥肌無力（MG）的主要致病性抗體，在MG的診斷、亞組分類和療效監(jiān)測中具有重要意義。
結合型AChRAb是最常檢測的抗體，目前常用方法有定量的酶聯(lián)免疫（ELISA）法和放射免疫沉淀（RIA）法以及半定量的細胞免疫熒光（CBA）法。無論商品化試劑盒還是實驗室自主開發(fā)的in-house試劑盒，驗證其臨床診斷效能既是檢驗醫(yī)生的課題，更是臨床醫(yī)生的課題。
在試劑盒開發(fā)過程中，往往采用從患者和對照取得的樣本，明確其敏感性、特異性等檢驗準確性的內在指標。定量檢測界值的設定對結果判斷分析的影響不應忽視，應該充分考慮診斷的實際需要以及漏診和誤診帶來的問題。
抗體陰性情況下，亦可通過新斯的明試驗和電生理診斷MG，但對不典型患者若僅有抗體陽性作為支持證據(jù)，則有可能誤診為MG而施以長期免疫治療，因此設定界值時需考慮在盡可能不減少敏感性的同時特異性適度優(yōu)先。MG合并其他自身免疫疾病較常見，自身免疫疾病導致的非特異性結合有可能使抗體測量值略有升高，與MG鑒別診斷的疾病中也常有自身免疫疾病。對照組的設置會影響界值的設定，納入適合的正常對照人群和其他自身免疫疾病對照人群至關重要。
通常I期診斷試驗僅有患者樣本而無患者的具體信息，而MG是異質性很強的疾病，其診斷效能需要在具有不同臨床特征的患者中驗證。II期診斷試驗納入疾病臨床譜系中不同特征者，有助于驗證真實世界的診斷效能；同時因納入健康人對照和疾病對照，在界值優(yōu)化過程中也充分考慮到鑒別診斷的疾病。因此，II期診斷試驗有助于同時解決上述兩個問題，建立合理的檢測界值并模擬真實世界人群驗證其診斷效能。
檢測結果有多種表達方法：ELISA法可表達為原始值（OD值）和轉化值（抑制率、根據(jù)標準曲線轉化而來的濃度[曲線濃度]、根據(jù)經驗公式轉化而來的濃度[經驗濃度]），RIA法表達為原始值（cpm值）和轉化值（結合率、經驗濃度）。
檢測界值設定可使用定性方法，其建立方法包括：
1、P/N比，為（待測樣本OD值-空白對照OD值）/（陰性樣本OD值-空白對照OD值），一般以P/N ≥ 2.1為陽性；
2、S/CO比，S是待測樣本OD值，CO為界值（cut-off），通常取值陰性對照平均值的2.1倍，間接法S/CO比 ≥1為陽性，競爭法S/CO比 ≤1為陽性。
目前更多使用定量方法設定界值，包括：
1、主觀法，包括1）符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集直接使用mean ± 3SD，2）不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集使用百分位數(shù)法或轉換法（轉換成正態(tài)分布后計算mean ± 3SD再轉換回去形成界值），3）無論是否為正態(tài)分布均使用健康對照（HC）和其他自身免疫疾病對照（OAD）的最高值（粗暴法）；
2、ROC法，通過最大Youden指數(shù)獲得。
研究設計和結果
1. 患者和對照組的納入標準和排除標準
從同期500例MG患者中通過匹配性別、年齡、病程、采集樣本時受累（眼肌型、全身型、緩解）、最嚴重時受累（眼肌型、全身型）、伴胸腺瘤者占比以及采集樣本時和最嚴重時的QMGs評分等關鍵臨床特征，選取77例與真實世界人群臨床特征分布相近的代表性MG患者構成研究隊列。
MG符合下列診斷標準：疲勞試驗陽性、新斯的明試驗陽性和RNS低頻遞減，診斷由兩名MG專家共識取得。
患者的臨床特征見表1，具有與真實世界隊列相似的代表性分布。
表1 納入MG患者的臨床特征
80例健康查體者作為HC，中位年齡37歲，IQR為19歲（20-68歲）。
80例其他自身免疫性疾病（OAD）患者，中位年齡47.5歲，IQR為19.75歲（25-81歲），包括視神經脊髓炎譜系疾病（n = 18）、多發(fā)性硬化（n = 11）、Guilian-Barre綜合征（n = 8）、 CIDP（n = 4）、橋本甲狀腺炎（n = 9）、Graves病（n = 1）、類風濕性關節(jié)炎（n = 13）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（n = 10）、銀屑病關節(jié)炎（n = 2）、系統(tǒng)性硬化癥（n = 1）、系統(tǒng)性血管炎（n = 1）、強直性脊柱炎（n = 1）和過敏性紫癜性腎炎（n = 1）。
以上包括神經免疫疾病和系統(tǒng)性自身免疫疾病。MG患者和對照均排除合并慢性感染性疾病者。
2. 檢測方法和結果數(shù)據(jù)
使用商品化競爭性抑制ELISA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。在AChRAb存在下，MAb1-AChR-MAb2-/MAb3復合物的形成受到抑制，使OD值下降；血清中AChRAb濃度越高，OD值越低。抑制率計算為：100 ×（1-檢測樣本OD/陰性對照OD），經驗濃度計算公式為：0.2 × 2(0.067×抑制率)。使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。沉淀物的放射性與AChRAb結合的放射標記AChR的量成正比。AChRAb濃度計算公式為：（檢測樣本cpm-陰性對照cpm）× A/（C × K × B × 2.22），其中A為碘125自生產日期到檢測日期時的衰減因數(shù)，B為計數(shù)器效率，C為檢測中使用血清量（μL），K為用于標記AChR時碘125標記毒素的活度（Ci/mmol）；A、C、K值將隨各個批次試劑盒提供。采用Levey-Jennings質控圖對每批次檢測的原始值進行質控，陽性對照在mean±2SD范圍內認為批次檢驗合格。所有檢測盲法完成。
根據(jù)AChR抗體商品化ELISA和RIA試劑盒說明書提供的界值，其中一種方法判定陰性即作為AChR抗體陰性患者，使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）檢測MuSK抗體，共在22例患者中檢出1例MuSK抗體陽性者。
結果：所有樣本均在各自檢測方法的檢測范圍內獲得檢測值。提示試劑盒的檢測范圍可涵蓋絕大多數(shù)患者和陰性對照。每批次檢測陽性質控品用Levey-Jennings質控圖評估后均符合質控要求。
3. 界值的優(yōu)化
3.1 去離群值
OD或cpm值超過mean±3SD者判定為離群值，在HC組和OAD組各發(fā)現(xiàn)1例離群值：HC組（OD=1.579, cpm=623.0）抗體水平較低，考慮為偶然誤差；OAD組（OD=0.985, cpm=4969.5）抗體水平較高，溯源發(fā)現(xiàn)為NMOSD患者，NMOSD與MG可能并發(fā)，但此例患者無MG臨床表現(xiàn)。最終79例HC和79例OAD納入分析。
3.2 批內和批間差異
結果：采用陽性質控品高、中、低三個濃度進行批內和批間質控，所有原始值和轉化值的變異系數(shù)（CV）均< 12%，顯示試劑盒檢測的可重復性。
3.3 確定界值
3.3.1 正態(tài)性檢驗和界值建立：
采用Shapiro-Wilk檢驗判斷原始值或轉化值是否符合正態(tài)分布。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)集采用mean+3SD或mean-3SD計算界值；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)集采用：1）97.5%分位或2.5%分位；2）轉換成正態(tài)分布數(shù)據(jù)后用轉換數(shù)據(jù)計算mean± 3SD再轉回作為界值。采用HC數(shù)據(jù)以及HC+OAD數(shù)據(jù)建立兩套界值。用HC+OAD數(shù)據(jù)集的最小值（OD值）或cpm值及所有轉化值的最大值形成一套界值（粗暴法）。從MG整組和HC+OAD組的OD或cpm值采用ROC獲得Youden指數(shù)最大時的界值。
結果：
用以上方法建立的界值見表2。以HC+OAD為對照組，采用粗暴法建立的界值與用mean±3SD統(tǒng)計法建立的界值接近，尤其是用原始值建立的界值。
表2 轉換方法、粗暴法和ROC法形成的界值
3.3.2 選擇界值：
以對照組的假陽性率低且MG組的陽性率下降不多為標準選擇界值。
結果：
以HC或HC+OAD作為對照，各界值的假陽性率和在MG組的真陽性率見表3。97.5%分位或2.5%分位法由于人為設定了假陽性率，獲得的界值最不理想，首先排除。以mean±3SD方法建立的界值中，以HC為對照形成界值的假陽性率顯著高于以HC+OAD為對照形成的界值。進一步散點圖（圖A、C分別為OD或cpm原始值，B、D分別為轉化值）分析可見OAD個體檢測到的抗體水平總體稍高于HC個體，提示自身免疫疾病的非特異性結合，證實選擇HC+OAD作為對照建立界值的合理性。采用HC+OAD為對照，采用統(tǒng)計法mean±3SD從原始值和轉化值建立的界值在對照的假陽性率為0~1.27%，在MG患者的真陽性率為74.03~77.92%。
表3 根據(jù)各界值得到的在對照個體的假陽性率和在MG患者的真陽性率
圖A~D OD值、cpm值和濃度值的離散性
3.3.3 選擇抗體水平的表達值
根據(jù)散點圖可見，HC和OAD的濃度值的離散程度均高于原始值（OD和cpm），因此將HC的原始值和轉化值的CV進行比較選擇最佳抗體水平表達值。
經過轉化后的數(shù)據(jù)，如果其變異較大，則有可能通過轉化工作曲線或公式放大其變異性。HC人群是理論上抗體水平變異最小的人群，因此進一步在HC個體原始值的10~90%范圍內等間隔選取數(shù)值計算轉化值進行模擬。
結果：原始值（OD或cpm）的CV最小（表4），模擬的結果也是原始值的CV最小（表5）。因此選擇原始值作為抗體定量檢測的表達值，并采用其相應界值完成后續(xù)分析。
表4 HC個體的原始值和轉化值的CV
表5 模擬計算得到的CV
采用原始值分析，用粗暴法建立的界值與用mean±3SD法建立的界值得到幾乎一樣的陽性率，進一步證實了原試劑盒采用粗暴法建立界值的合理性。但ROC法結果建立的界值雖然MG的真陽性率稍高，但對照組中的假陽性率明顯增高，因此無法作為界值（表3）。
表6 在MG整組及各亞組的診斷效能（最上一行[Ref]是整組使用試劑盒界值的結果，其他均為本研究建立的界值的結果）
5. 比較ELISA法和RIA法的檢測一致性
5.1使用散點圖判斷兩種方法抗體陽性者的一致性（圖E）
5.2 Spearmen秩相關判斷兩種方法抗體定量的一致性
結果：MG整組OD值和cpm值具有良好相關性（rs=-0.92, 95%CI: -0.95~-0.88, p<0.01, n=77）（圖F），用兩種方法檢測均判為AChRAb陽性者也有良好相關性（rs=-0.84, 95%CI: -0.91~-0.74, p<0.01, n=55）。
圖E 散點圖判斷AChRAb陽性者的一致性 圖F AChRAb定量值的相關性
5.3 定性判斷兩種方法的檢測一致性
分別用ROC曲線、Kappa檢驗和McNemar卡方檢驗判斷兩種方法的檢測一致性。
結果：ROC曲線顯示ELISA和RIA法檢測抗體陽性者間有良好的一致性（圖G，ELISA的AUC 95%CI: 0.89~0.97，RIA的AUC 95%CI: 0.90~0.98）。采用mean±3SD法建立的界值，陽性者在MG整組及其亞組均有中到高度的一致性，McNemar檢驗，p均>0.05；Kappa檢驗，加權к為 0.71~1.00，p均<0.01（表7）。采用ROC法建立的界值在MG整組的陽性者一致性較差，McNemar檢驗，p<0.01；加權к為0.66，p<0.01。
表7 各組患者用兩種方法判斷AChRAb陽性率的一致性及組間差異
圖G ROC法比較抗體陽性的一致性 圖H和I 雙圖ROC法進行抗體陽性者的一致性分析
5.4 兩種方法檢測不一致者的分析
觀察MG患者兩種方法檢測判斷抗體陽性的一致性，并用雙圖ROC法判斷不一致者是否落在灰區(qū)內。灰區(qū)指臨界值，取界值相應的敏感性和特異性兩側的10%為臨界（圖H和I）。
結果：55名MG患者ELISA和RIA法均為陽性，18名患者兩種方法均為陰性，4名（7.3%）患者在陽性判斷不一致。兩名患者ELISA法（OD 1.59和1.60，界值≤1.79）判為陽性而RIA法（cpm 1105.50和1179.00，界值≥1234.12）判為陰性。兩名患者ELISA法（OD 1.88和2.02）判為陰性而RIA法（cpm 2211.50和2769.00）判為陽性。落在灰區(qū)中者ELISA法10例，RIA法15例。兩種方法不一致者落在灰區(qū)中的ELISA法4例，RIA法3例。
兩種檢測方法陽性者的不一致主要來自檢測灰區(qū)（即臨界值范圍）。
6. 抗體水平與MG臨床特征間的關系
6.1 各臨床特征亞組兩種方法判斷AChRAb陽性者的差異
結果：以年齡、性別、胸腺瘤、采集樣本時的肌肉受累和嚴重程度（QMGS評分）分組，結果見表7。采樣時全身型和嚴重者的陽性率顯著高于其對應亞組。
6.2 各臨床特征亞組AChRAb水平的差異
結果：各亞組的兩種方法的定量檢測值見圖J和L。年齡大、伴胸腺瘤、采樣時全身型及嚴重者的AChRAb水平高于其對應亞組。
圖J和圖L ELISA法和RIA法定量檢測值在不同亞組間的差異
6.3 QMGs與抗體水平的相關性
結果：在兩種方法檢測均判為陽性者（n=55），ELISA法（rs=-0.60，95%CI -0.75~-0.39， p<0.01）和RIA法（rs=0.57，95%CI 0.36~0.73，p<0.01）檢測的抗體水平與QMGs中度相關。
圖K和M AChRAb陽性者ELISA法和RIA法檢測值與QMGs的相關性
優(yōu)勢和不足
1. 優(yōu)勢：
（1）以HC+OAD為對照，采用系統(tǒng)化的方法優(yōu)化定量檢測的界值。
（2）采用主要臨床特征代表性的抽樣人群，并在MG整組及亞組驗證界值的診斷效力。
（3）詳細分析陽性者和檢測值與臨床特征的關系。
2、不足
（1）OAD對照不是MG的常見鑒別診斷疾病。但多數(shù)鑒別診斷疾病可通過病史、神經系統(tǒng)檢查和其他實驗室檢查來鑒別，而本研究設置OAD對照的目的是消除自身免疫背景所致的非特異性結合。
（2）HC和OAD組的樣本量較小。但給我們分析數(shù)據(jù)正態(tài)分布與界值關系提供了良好的機會，通過轉換成正態(tài)分布，我們建立的界值獲得了良好的診斷效力。
編輯：李尊波/謝琰臣；顧問：許賢豪。
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