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一、ATCC菌種操作步驟

1．扦片法

1)倒平板

取熔化并冷卻至大約50℃的高氏Ⅰ號瓊脂約20mL倒平板，凝固待用。

2)接種

用接種環挑取菌種斜面培養物(孢子)在瓊脂平板上劃線接種。劃線要密些，以利于扦片。

3)扦片

以無菌操作用鑷子將滅菌的蓋玻片以大約45。角扦入瓊脂內(扦在接種線上)(圖2-16)，扦片數量可根據需要而定，扦人深度約為蓋玻片的1／3左右。接種與扦片的順序也可以互換，即先扦片，再接種：先扦好蓋玻片，然后在交界線蓋玻片的正面一側劃線接種(劃在蓋玻片的正中央一半長度即可，兩段留出空白，以備放線菌菌絲蔓延)。這種互換的好處是鏡檢時無需擦除蓋玻片背部菌絲體。

4)培養

將扦片平板倒置，28℃培養。培養時問根據觀察目的而定，通常3～5d。

5)鏡檢

用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養物，然后將有菌的一面朝上放在載玻片上，直接鏡檢。

觀察時，宦用略暗光線；先用低倍鏡找到適當視野，再換高倍鏡觀察。用0．1％亞甲藍對培養后的蓋玻片進行染色后觀察，效果會更好。

2．玻璃紙法

1)倒平板

與扦片法相同。

2)鋪玻璃紙

以無菌操作用鑷子將已滅菌(155～160℃干熱滅菌2h)的玻璃紙片(蓋玻片大小)鋪在培養基瓊脂表面，用無菌玻璃涂棒(或接種環)將玻璃紙壓平，使其緊貼在瓊脂表面，玻璃紙和瓊脂之問不留氣泡。每個平板可鋪5～10塊玻璃紙。也可用略小于平皿的大張玻璃紙代替小玻璃紙片，但觀察時需要再剪成小塊。

3)接種

用接種環挑取菌種斜面培養物(孢子)，在玻璃紙上劃線接種。

4)培養

與扦片法相同，將平板倒置，28℃培養3～5d。放線菌的孢子能在表面的玻璃紙上形成菌落。

5)鏡檢

在潔凈載玻片上加一小滴水，用鑷子小心取下玻璃紙片，菌面朝上放在玻片的水滴上，使玻璃紙平貼在玻片上(中間勿留氣泡)。先用低倍鏡觀察，找到適當視野后換高倍鏡觀察。操作過程中勿碰動玻璃紙菌面上的培養物。

3．印片法

1)接種培養

用高氏Ⅰ號瓊脂平板常規劃線接種或點種，28℃培養4～7d，也可將用上述兩種方法得到的瓊脂平板上的培養物作為制片觀察的材料。

2)印片

用接種鏟或解剖刀將平板上的菌苔連同培養基切下一小塊，菌面朝上放在一載玻片上。另取一潔凈載玻片置火焰上微熱后蓋在菌苔上，輕輕按壓，使培養物(氣絲、孢子絲或孢子)黏附(“印”)在后一塊載玻片的中央，有印跡的一面朝上，通過火焰2～3次固定。印片時不要用力過大壓碎瓊脂，也不要錯動，以免改變放線菌的自然形態。

3)染色

用苯酚復紅覆蓋印跡，染色約1min后水洗。

4)ATCC菌種鏡檢

干后用油鏡觀察。
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ATCC菌種