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ATCC菌種實驗保存方法
閱讀:291 發布時間:2017-7-12ATCC菌種可不必提取基因組DNA,不必酶切鑒定,而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增,省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。zui后的PCR產物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。
具體方法:
1、PCR混合物的制備
taq buffer(10×) 20 ul
dNTP(2.5 mM) 5 ul
primer Forward(50 mM) 10 ul
Primer Reverse(50 mM) 10 ul
ddH2O 147 ul
Taq(2U/ul) 8 ul
total 200 ul
將上述溶液混勻,10 ul每管分裝于200 ul pcr管中。
2、常溫下隨機挑選轉化板上的轉化子,用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體,在LB瓊脂糖平板上輕點,做一拷貝;然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數下(管子做好記號,如平板上點的是1#,則管子上也標1#,以便篩選到克隆后的擴到培養),蓋緊管子。
3、將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中,按常規條件擴增。電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。
4、將已經接種有菌落的平板置37℃培養箱培養過夜,使ATCC菌種擴增;次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養。步驟2也可以不點板,直接接種搖菌,如果早上做PCR的話,下午就可以提質粒,得到重組載體。
注意事項:設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆,用載體上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如單酶切或平末端連接),一條引物用載體,一條引物用目的基因上的,這樣就可以比較方便的鑒定了,而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近,同時挑取的ATCC菌種不宜太多,否則會有非特異性擴增。