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影響人正常組織來源細胞轉染效率因素有哪些?
閱讀:232 發布時間:2018-4-4影響人正常組織來源細胞轉染效率因素主要有三個,細胞種類(狀態)、質粒以及轉染試劑。為了得到一個好的轉染結果,我們要像下面這樣做。
轉染前
1、轉染前細胞的狀態和密度都非常影響轉染效率和后期的實驗結果。轉染時細胞的密度為50%-80%較好,同時注意在轉染后收細胞時的密度不要過高。
比如轉染質粒到細胞內,48小時后做WB,那么此時細胞的密度不要長滿. 因為細胞長的過高嚴重影響細胞的狀態(周期進程阻滯,凋亡增加等)從而影響實驗結果。一般為前一天下午鋪板,第二天上午進行轉染,48小時后收細胞進行功能檢測。
2、不同的質粒和脂質體*搭配比例不同,轉染前,應該摸一個*配比。可以按照質粒:脂質體=1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5的梯度比例來檢測*轉染比例。
3、支原體污染會嚴重影響細胞轉染的效率,且支原體污染不會像細菌污染那么明顯可見,轉染前可以用環丙沙星殺一殺支原體。
轉染時
轉染時
1、轉染時,要小心輕柔的將lipo2000加到培養基中并輕輕混勻(說明書上的用詞為:Mix gently),避免粗暴用力吹打,會導致脂質體失效。
2、轉染時各種培養皿添加的質粒和脂質體參考量對查看相對應的表!
轉染后
1、現在大多數轉染試劑可以使用帶血清的培養基進行轉染,轉染后6小時更換培養基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培養基需要更換成有血清培養基。
2、轉染后效率的檢測:
(1)觀察轉染后細胞熒光情況
(2)qPCR驗證。
(3)WB檢測敲減或者過表達蛋白。
3、人正常組織來源細胞轉染后發現轉染效率不高,可以通過兩種方法:
(1)復轉染,即轉染后12-24小時再次進行轉染,前提是該細胞對脂質體的耐受性較好,轉染后細胞死亡數較少。
(2)通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。
Lumefantrine 苯芴醇標準品 82186-77-4 100mg
Bismuth Citrate 枸櫞酸鉍標準品 813-93-4 100mg
Clarithromycin 克拉霉素標準品 81103-11-9 100mg
Fluticasone Propionate 氟替卡松丙酸酯標準品 80474-14-2 100mg
Sertraline Hydrochloride 鹽酸舍曲林標準品 79559-97-0 100mg
Mebrofenin 甲溴菲寧標準品 78266-06-5 100mg
碘海醇相關物質C標準品 76820-34-3 100mg
Terfenadine Related Compound A 特非那定相關物質A標準品 76815-60-6 100mg
Docusate Potassium "
1,2-二(2-乙基己基氧碳基)乙烷磺酸鉀標準品 7491-09-0 100mg
人正常組織來源細胞