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細胞培養時消化液的配制
閱讀:316 發布時間:2017-6-27提 供 商 | 上海谷研實業有限公司 | 資料大小 | 28.9KB |
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經常使用的是胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液,傳代時用以使細胞脫離附著底物表面和離散成單個細胞。它們可以單獨使用,也可按一定比例混合一起使用,這主要根據細胞的要求,可自行試驗以做取舍。從經濟和使用方便考慮,因EDTA易獲得和易配制,可以選擇作為常用的消化液。
1.胰蛋白酶溶液:胰蛋白酶主要采自?;蜇i的胰臟,是一種黃白色粉末,易潮解,應放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細胞間的蛋白質水解,使細胞相互離散。胰蛋白酶的活力是用解離酪蛋白的能力表示的,經常使用的有 1:125 和 1:250 的兩種濃度,即1份胰蛋白酶能分別解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的特性有密切關系。不同的細胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不一樣。一般來講,濃度大、溫度高、作用時間越長,對細胞分離能力也越大,但超過一定的限度也會損傷細胞。胰蛋白酶溶液在 pH 8.0,溫度為37℃時,作用能力zui強。此外,許多學者認為,Ca2+ 、Mg2+ 和血清中蛋白質的存在會降低其活力。所以常用無 Ca2+ 、Mg2+ 的溶液配制。消化細胞時,加入一些血清或含血清的培養液,或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對細胞的繼續作用。
在國外的的目錄中.除我們常用的較為粗制的混合型胰蛋白酶外,還有從中提取純化的各種亞型的精制胰蛋白酶產品,它們對某種特定組織解離作用較強,可以用于特殊需要.但價格較為昂貴。胰蛋白酶溶液的配制方法如下。
(1)將D-Hartks 液或 Duldecco 鹽溶液高壓消毒滅菌,用 NaHCO3 液調節pH至 7.2 左右。
(2)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中,先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀,然后再補足鹽溶液,攪拌混勻,置室溫4h或冰箱內過夜,并不時攪拌振蕩。
(3)次日先用濾紙粗濾,再進行過濾除菌,分裝入瓶中,低溫冰箱保存備用,常用濃度為0.25%或0.125%;胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可調pH至7.2左右。2.EDTA溶液:EDTA是一種化學螯合劑,其溶液又稱VerSen液,對細胞有一定的解離作用,并且毒性小,價格低廉,使用方便。使用濃度一般為0.02%,但某些個別細胞系要求濃度較高。用無鈣、鎂鹽溶液溶解后,高壓蒸氣滅菌,分裝成小瓶,室溫或4℃冰箱保存。
3.膠原酶溶液膠:原酶在上皮類組織原代培養時用于組織細胞的解離,作用的對象是膠原組織,不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1~0 3mg~/L或200 000U/L,作用的*州為6.5。膠原酶不受Ca2+ 、Mg2+ 及血清的抑制,配制時可用 PBS。