亚洲中文久久精品无码WW16,亚洲国产精品久久久久爰色欲,人人妻人人澡人人爽欧美一区九九,亚洲码欧美码一区二区三区

材料
1．轉化細胞的制備經(jīng)過原代或傳代培養(yǎng)的細胞。
2．培養(yǎng)用液克隆適應培養(yǎng)液、Hanks液、0.125％胰蛋白酶。
3．培養(yǎng)用品包括直徑為0.5mm，長為8mm的毛細玻璃管，培養(yǎng)瓶皿、培養(yǎng)板（24孔、96孔）、吸管、微量加樣器等。
方法
1．稀釋克隆法
（1)毛細管克隆法
1)將一定量的細胞懸液（如105個／ml或更低）倍比稀釋至1個／ml;
2）取l0ml稀釋的細胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細玻璃管若干（30～50支），在負壓作用下，將懸液吸入各毛細管中；
3）在倒置顯微鏡下檢查出每管只有1個細胞的毛細管，然后放入適應性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶（皿）內，置37℃ ,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當一個細胞在毛細管內繁殖后向管外擴展時，會形成單細胞克隆的細胞群體。
(2）有限稀釋鋪板法：有限稀釋需將細胞懸液在一排試管中進行梯變倍數(shù)稀釋，然后將稀釋的細胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板（也可在96孔板上直接稀釋），使每孔僅含1個細胞。經(jīng)鏡下檢測，標記下含單細胞的孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。數(shù)日后，凡在已標記的孔中有生長增殖的細胞集落即為克隆細胞。
1)低密度細胞懸液的制備：選用對數(shù)生長期的狀況良好的待克隆細胞，如為貼壁細胞則先用胰蛋白酶消化，使其脫離瓶壁，經(jīng)反復吹打使細胞相互分離，用培養(yǎng)液梯變倍數(shù)稀釋細胞，分別稀釋成50/m1,10/m1,5/ml三種稀釋度的細胞懸液。
2)接種：先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使之混懸均勻。將三種稀釋度的細胞分別用加樣器接種于96孔培養(yǎng)板，每孔分別加100ul細胞懸液（100ul內平均細胞分別為5,1,0.5個細胞）和100ul培養(yǎng)液。接種時要迅速準確，爭取在zui短時間內加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)。迅速蓋好蓋板，置于37℃,5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3）標記與培養(yǎng)：培養(yǎng)6～12小時待細胞下沉并貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出培養(yǎng)板，置于倒置顯微鏡臺上，觀察和標記下含單個細胞的孔。以單個細胞落于孔底平坦部而周邊清晰者為符合要求。然后，送回C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間視其pH的變化決定是否換液或補加培養(yǎng)液。
4）分離擴大培養(yǎng)：將接種細胞培養(yǎng)72～96小時后進行觀察。挑選生長良好的單細胞克隆孔。先吸去舊培養(yǎng)液，用Hanks液洗1～2次。然后加胰蛋白酶溶液少許進行消化。置于倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓時，加入0.1 ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打，當細胞脫壁懸浮后，一并吸入24孔板或另一培養(yǎng)瓶中，補加一定量培養(yǎng)液，置C02培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。待形成新的細胞群體后，即轉用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。
2．飼養(yǎng)層克隆法分離的單個細胞和密度極低的分散細胞很難存活和增殖，為了促使剛剛克隆化的極少量細胞生長繁殖，常采用“飼養(yǎng)細胞（feeder cell)”促進克隆細胞的增殖。常用的飼養(yǎng)層細胞有成纖維細胞、胸腺細胞和巨噬細胞等。
(1)飼養(yǎng)層的制備：取人或動物胚胎成纖維細胞，待轉化細胞生長至旺盛的對數(shù)生長期時，用60Coγ射線以40～60Gy單次照射細胞，其目的是使細胞喪失有絲分裂能力，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH值而且還可為克隆細胞提供必要的養(yǎng)分及其刺激生長因子。將飼養(yǎng)層細胞制備成細胞懸液，接種入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48小時，便可直接作飼養(yǎng)細胞之用。
(2）接種細胞：先將經(jīng)60Coγ射線照射過的飼養(yǎng)細胞準備好待用；然后取生長至指數(shù)增生期的用作克隆的細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成細胞懸液，細胞計數(shù)并將其稀釋成20～200/ml;棄掉飼養(yǎng)細胞瓶內培養(yǎng)液，注入稀釋的待克隆細胞懸液。做飼細胞層克隆細胞時，還應設對照組，對照組中只接種待克隆細胞懸液，沒有飼細胞層。
(3）克隆形成：將待克隆的細胞懸液接種到飼養(yǎng)細胞層后，培養(yǎng)2～3周，每周換液一次，待克隆出現(xiàn)后，或分離，或計算克隆形成率。
3．膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法原代培養(yǎng)細胞容易黏附于膠原膜層或血纖維蛋白膜層等生長基質成分之上。在細胞克隆中，用膠原膜層或血纖維蛋白膜層代替飼養(yǎng)細胞，可幫助單個細胞和密度極低的分散細胞都附著貼壁、存活并逐漸繁殖。以血纖維蛋白膜層板為例介紹細胞克隆技術。
(1)血纖維蛋白膜層的制備
1)取0.2ug凝血酶溶于l00ml克隆培養(yǎng)液中，制成A液；另取250mg牛血纖維蛋白原，800mg NaCl和25 mg枸櫞酸鈉，共溶于l000ml重蒸水中，制成B液。
2)取B液1ml和A液4ml，放入培養(yǎng)皿內盡快混合，幾分鐘后即形成透明膠層。
(2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細胞
1)取處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，用胰蛋白酶溶液消化后制備細胞懸液。
2)用培養(yǎng)液稀釋細胞懸液，一般以每一培養(yǎng)器皿內生長1～10個克隆的細胞濃度為zui適。例如，克隆效應為5％～10％時，則一個器皿內接種100個細胞為宜。
3）將細胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質層的培養(yǎng)器皿內，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換培養(yǎng)液1次。
(3)觀察并計數(shù)克隆之數(shù)目：幾周后可見有由500～1000個細胞形成的群落。
4．軟瓊脂克隆分離法瓊脂層是一種簡單的生長基質層，可幫助細胞貼附生長。但瓊脂中含有酸性硫酸多糖，對大多數(shù)細胞有一定的抑制作用。對于正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆，本法僅適于懸浮培養(yǎng)的淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞。目前多用半固體培養(yǎng)基克隆方法。
(1)制備細胞懸液：將對數(shù)生長期細胞制成單個細胞懸液（貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化，使之分散成單個細胞），做活細胞計數(shù)，調整細胞密度至（1～5)×104個細胞／L。
(2）制備底層瓊脂：取5％瓊脂置沸水浴中使瓊脂*溶化，取出1份5％瓊脂移入小燒杯中，待冷卻至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5％瓊脂），均勻后立即澆入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5％瓊脂培養(yǎng)基0. 8ml，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。
(3)制備上層瓊脂：取37℃保溫的不同密度的細胞懸液9.4ml移入小燒杯中，加入50℃的5%瓊脂0.6ml，迅速混勻，即配成0.3％瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有（或無）底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔加0.8 ml，置室溫使瓊脂凝固。每孔細胞數(shù)量可根據(jù)細胞生長速度和實驗目的來確定。一般可調整每孔含25,50和100個細胞的梯度密度。
(4)培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)板于37℃ ,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周或更長，若需培養(yǎng)更長時間，每孔可補加0.8ml含瓊脂的培養(yǎng)液，注意觀察培養(yǎng)液的顏色變化和有無明顯集落形成，培養(yǎng)液變酸要及時換液，集落形成要計數(shù)克隆數(shù)或取克隆細胞擴大增殖。
【結果及注意事項】
1．觀察結果并集落（克隆）計數(shù)在倒置顯微鏡下觀察結果，計數(shù)直徑大于75 um或含有50個細胞以上的集落。經(jīng)培養(yǎng)后能夠增殖形成克隆的百分率稱集落（克隆）形成率( cloning efficiency)，以下述公式計算。

2．克隆形成率與接種細胞的密度有一定的相關性。細胞懸液的細胞密度越大，接種時每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細胞越多，克隆的形成率就越低。為提高克隆形成率，須將細胞懸液稀釋成密度為10/ml，甚至更低，接種的密度也要小。見表3-2。

3．細胞克隆形成率低于10％應采取增強細胞同化能力的措施。如①選定克隆形成效率比較高的培養(yǎng)液作為zui適的克隆化培養(yǎng)液；②用胎牛血清作培養(yǎng)液中的血清成分，比小牛血清*；③調控C02濃度，C02可提高絕大多數(shù)細胞克隆形成率，常用5％濃度。對有的細胞，如人成纖維細胞和神經(jīng)膠質細胞克隆時，2％的C02效果可能更好。HEPES (20mmol/L )與2％的C02配合使用能很好緩沖培養(yǎng)液pH值的波動，使細胞盡量少受這一因素的影響。
適應培養(yǎng)基中加入添加細胞刺激因子，某些激素（如胰島素、地塞米松等）和生長因子有促進細胞克隆形成的作用。含1～lOIU/ml胰島素的培養(yǎng)液對許多種細胞的克隆形成均有促進作用。地塞米松也能提高人正常神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)膠質瘤細胞、成纖維細胞、黑色素瘤細胞等的克隆形成率。而表皮生長因子可促進角質細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等生長，推薦使用濃度為1～20ng/ml。
4．飼養(yǎng)細胞在體外培養(yǎng)時，單個細胞和密度極低的分散細胞很難存活和逐漸繁殖。飼養(yǎng)細胞為克隆細胞創(chuàng)造了適宜生長的微環(huán)境。飼養(yǎng)細胞也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射處理的、供其他細胞附著的細胞層。飼養(yǎng)細胞受射線照射后，失去其分裂能力，但仍存活并有同化營養(yǎng)液的能力，待克隆的細胞散落在飼養(yǎng)細胞上層并與之接觸。細胞克隆形成后，飼養(yǎng)細胞逐漸死亡，換液時可被清除。
5．增強轉化細胞的貼壁能力以促進細胞克隆形成一種簡單的生長基質層是瓊脂層，常用濃度為2%。瓊脂層制備后，可把細胞接種在瓊脂層上。惡變細胞或惡性轉化細胞在軟瓊脂(1.2%）中的生長，與在裸鼠體內的致瘤性有很大一致性。因此測試細胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉化細胞惡性的重要指標。原代培養(yǎng)的細胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長基質上。用多聚右旋賴氨酸（poyrylysine）包被培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿底壁，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細胞克隆形成率。其包被方法是：①配制濃度為1mg/ml的多聚右旋賴氨酸水溶液，用以濕潤培養(yǎng)瓶底；②倒出多聚賴氨酸溶液，用5m1 PBS沖洗培養(yǎng)瓶皿1次后，即可立即使用。用培養(yǎng)液配制的濃度為5 ug/ml的纖維粘連蛋白（fibronectin )處理培養(yǎng)瓶后亦有類似效應。