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RNA提取成功的要點有哪些?
RNA是目前發現細胞內生物功能zui豐富多樣的生物大分子,同時是DNA與蛋白質信息傳遞的橋梁,因此完整RNA的提取和純化是功能基因組時代的重要手段。那么你知道RNA提取成功的要點有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!
1. 組織樣本要盡可能的新鮮,避免反復凍融。
2. 提取時組織要充分研磨,組織量不宜過少,更不宜過多。
3. 加入裂解液后應給予充分的孵育時間,使樣本充分裂解。
4. 在用Trizol法提取時,分層后吸取上清的原則是“寧愿少吸,不能多吸",千萬不能提取到中間層,否則會導致嚴重的基因組DNA污染。
5. 洗滌時洗滌液應充分浸潤到管壁的四周,確保洗滌che底。
6. 柱式提取法,洗滌完后除了對柱子進行空離后,還應當將吸附柱置于超凈臺內吹風5~10 min,使有機溶劑充分揮發干。
7. 柱式法最后洗脫時候,當加入DEPC水后還應孵育3~5 min,或者提前將DEPC水加熱至60℃,可提高洗脫得率。傳統的Trizol裂解異丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀,則應當給予適當溶解時間,并用槍頭不斷吹吸離心管底部。
8. 預防RNase污染,應注意以下幾個方面:
(1)經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌,可能導致RNase污染。
(2)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
(3)RNA在Trizol試劑中不會被RNase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,然后用水che底清洗,再滅菌,即可去除RNase
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