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細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)與方法
細(xì)胞凋亡(Apoptosis),又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序,自己結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的,高度有序的,基因控制的,一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞凋亡概念提出今還不到30年的時(shí)間,但由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色,對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用,引起了人們對(duì)其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究,成為目前生命科學(xué)界熱門(mén)話題之一,也是生命科學(xué)界乃社會(huì)各界爭(zhēng)相投入的研究領(lǐng)域。從近年的SCI排名中我們可以看到,信號(hào)傳導(dǎo)方面的文章遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)位于第二位的人類基因組方面的,而信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要的前沿領(lǐng)域就是細(xì)胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續(xù)升溫,涌現(xiàn)出了大量新的技術(shù)和方法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè),其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現(xiàn),大大加速了研究的進(jìn)程。具體來(lái)說(shuō),針對(duì)凋亡的不同階段有以下一些方法:
1. 早期檢測(cè):
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細(xì)胞外膜上的檢測(cè):
PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV,一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS,再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)(懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
BioVision公司位于美國(guó)加州,是世界上專著于凋亡和細(xì)胞信號(hào)研究的公司。其產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉、包裝使用方便。BioVision提供多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品,并有與核染料PI組成完整早期凋亡檢測(cè)試劑盒。
BMS(Bender Medsystems)公司擁有Annexin V專li權(quán),可提供各種規(guī)格的Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒。其中Annexin V FITC試劑盒中包含Annexin V和核染料PI,且具小包裝,適合檢測(cè)小樣本的客戶。
另外,Biovision公司和德國(guó)美天妮公司提供磁珠包被Annexin V,可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。
2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè):
正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中,細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí),細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低,從而使細(xì)胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中,啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān),此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外,還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如:HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測(cè)。
3)細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)
細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì),在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中,凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放細(xì)胞液,結(jié)合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng):細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白,凋亡發(fā)生時(shí),它保留在線粒體內(nèi),因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。Cytochrome c Apoptosis Assay Kit試劑盒可以有效地檢測(cè)凋亡過(guò)程中細(xì)胞色素c的釋放情況。
4) 線粒體膜電位變化的檢測(cè):
在凋亡研究的早期,從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入,發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分,發(fā)生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑,對(duì)此改變非常敏感,呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中,它在線粒體中形成聚集體,發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在于細(xì)胞液中,發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。Biovision公司的MitoCaptureTM Mitochondrial Apoptosis Detection Kit(MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測(cè)試劑盒)可以簡(jiǎn)單、靈敏地體外分析、檢測(cè)線粒體在凋亡過(guò)程中的變化。
2. 晚期檢測(cè):
細(xì)胞凋亡晚期中,核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200 bp 的片段。
1) 凋亡 DNA Ladder 檢測(cè)試劑盒
細(xì)胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit可以快速(約1-2小時(shí))、靈敏地檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的片段。
2) TUNEL-based DNA 分析試劑盒
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。Apo-BrdUTM分析使用2種顏色的TUNEL方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞中DNA條帶。采用的BrdU比生物素標(biāo)記的或地gao辛(digoxigenylated)標(biāo)記的方法靈敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一種完整的試劑盒用于雙色的免疫組化(IHC)檢測(cè)片段。Apo-DIRECTTM是非常簡(jiǎn)單的一步標(biāo)記凋亡細(xì)胞,用于流式細(xì)胞術(shù)分析。
3)Caspase分析試劑和試劑盒
Caspase在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用,屬于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。在正常狀態(tài)下,caspase家族都以無(wú)活性的酶原(30~50kD)形式表達(dá),Caspase酶原由原結(jié)構(gòu)域、大亞基(~20kD )和小亞基(~10kD )構(gòu)成。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)caspase可以被蛋白酶裂解,大亞基和小亞基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),促發(fā)細(xì)胞凋亡。
Biovision公司作為世界ling先的細(xì)胞凋亡試劑研發(fā)和供應(yīng)商,可以提供全面的、高質(zhì)量的caspase相關(guān)檢測(cè)試劑。