收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱(chēng)

名稱(chēng)    大鼠棕色前脂肪細(xì)胞

2.組織來(lái)源：脂肪組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠棕色前脂肪細(xì)胞分離自棕色脂肪組織；動(dòng)物體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪，白色脂肪堆積在皮下，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存多余熱量；棕色脂肪負(fù)責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳、水和熱量，本身不儲(chǔ)存熱量。棕色脂肪組織呈棕色，其特點(diǎn)是組織中有豐富的毛細(xì)血管，脂肪細(xì)胞內(nèi)散著許多小脂滴，線粒體大而豐富，核圓形，位于細(xì)胞中央，這種脂肪細(xì)胞也稱(chēng)為多泡脂肪細(xì)胞。棕色脂肪組織在成年動(dòng)物極少，新生兒及冬眠動(dòng)物較多，在新生兒主要分布在肩胛間區(qū)、腋窩及頸后部等處。棕色脂肪組織僅在嬰兒時(shí)期發(fā)揮作用，它們堆積在新生兒肩胛處，幫助維持體溫。隨著年齡增長(zhǎng)，棕色脂肪會(huì)逐漸消失。最終，動(dòng)物體內(nèi)只殘存少量棕色脂肪細(xì)胞，分布于頸部和鎖骨。脂肪組織在體內(nèi)含有兩種主要的細(xì)胞：一種是在胞漿內(nèi)積聚脂滴的成熟脂肪細(xì)胞；另一種是雖未在胞漿內(nèi)積聚脂滴但有這種潛能的前脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞呈梭形，有分裂和增殖的能力；成熟的脂肪細(xì)胞呈圓形，已經(jīng)失去了分裂及增殖的能力。由于前脂肪細(xì)胞是一類(lèi)具有增殖和向脂肪細(xì)胞分化能力的特異化前體細(xì)胞，與肥胖有著非常密切的關(guān)系。前脂肪細(xì)胞是一種類(lèi)成纖維細(xì)胞，在演變的過(guò)程中不斷吸收脂質(zhì)，最終成為成熟的脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞對(duì)外界機(jī)械損傷的抵抗力較強(qiáng)，可望成為軟組織缺損的有益填充物。

5.方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠棕色前脂肪細(xì)胞采用膠原酶消化法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠棕色前脂肪細(xì)胞經(jīng)油紅O染色檢測(cè)，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號(hào)CM-R228

換液頻率每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)成纖維細(xì)胞樣

傳代特性可傳5代左右；3代以?xún)?nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí)。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類(lèi)而異。腺癌類(lèi)的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類(lèi)細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。