簡介
單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 是一種用于對復(fù)雜細胞 和組織樣本中的基因表達進行無偏差表征的技術(shù)。盡管 scRNA-seq chedi改變了現(xiàn)代生物學(xué)，但在技術(shù)上仍然具 有挑戰(zhàn)性，并且通常成本高昂。目前市場上的解決方案能夠在擁有數(shù)萬個細胞的初始池時對一小部分細胞進行有效分析。然而，處理稀有細胞群的 scRNA-seq 文庫制備 的簡化方案仍然缺失。 在這里，我們開發(fā)了一種新型孔板檢測法，用于性價比 高且高度 敏 感的 scRNA-seq。該工作流 程 支 持 來自稀 有細胞群的稀有樣本文庫制備。在此新工作流程中 ( 圖 1 )，我 們 使 用 了 DispenCell 和專用檢測吸頭 ( SEED Biosciences，瑞士 )，與專用和優(yōu)化的單細胞文庫制備系統(tǒng) ( MERCURIUS 高靈敏度 BRB-seq 試劑盒，Alithea Genomics，瑞士 )。
單細胞分配
首先，在測序文庫制備之前，我們測試了 DispenCell 在專用裂解緩沖液中分配單細胞的能力。淋巴細胞系從冷凍的小瓶中解凍，傳代兩次，然后在單細胞懸浮液中收 獲。使 用 10 μm 細胞過濾器 ( Miltenyi Biotec，德 國 ) 過濾細胞，計數(shù)并在無 RNAse 的甲基纖維素分配溶液 (DispenMe、SEED Biosciences) 中 稀 釋 至 最 終 濃 度 為 2×104 cells/mL。 然 后，使 用 DispenCell 傳感吸頭從細胞懸浮液中裝載 200 個 細 胞。設(shè) 置 DispenCell 將單細 胞分配 到 384 孔 板，孔板預(yù)裝 4.2 μL 裂解緩沖液 ( HS BRB seq 試劑盒， Alithea Genomics )。前 96 個孔 分 配 大 約 7 分鐘。然 后，停止分配，因為我們有足夠的樣品進行下游分析。
單細胞質(zhì)量控制
分配后，我們立即使用 SEED Biosciences 開發(fā)的軟件 DispenSoft 進行單細胞質(zhì)量控制后處理?？装宓拿總€孔 用顏色編碼的矩陣表示 ( 圖 2.a)。 當孔中含有單個細胞時，軟件將其標記為綠色，而紅色 孔中則含有零個或多個細胞，應(yīng)丟棄。為了區(qū)分碎片和細 胞，通過對基于大小的直方圖進行門控來設(shè)置閾值 ( 圖 2.b )。只有高于閾值的峰才算作細胞。
在這里，我們獲得了 77 個單細胞孔 ( 80% 單細胞分離 率 )。使用 DispenSoft，原始阻抗數(shù)據(jù)也可用于記錄過程。可手動檢查每個阻抗曲線。單尖峰是單細胞的特征 ( 圖 2.c ) 而多個細胞產(chǎn)生多個峰。這表明 DispenCell 能 夠以簡單、快速和wanquan可追溯的過程在裂解緩沖液中分 配單細胞。