簡(jiǎn)介

近年來(lái)，在開發(fā)腫瘤細(xì)胞體外聚集體以用作體內(nèi)組織環(huán)境模型方面取得了顯著進(jìn)展。當(dāng)接種至超低黏附圓底微孔板的一個(gè)孔中時(shí)，這些聚集體會(huì)形成一個(gè)離散的細(xì)胞球。細(xì)胞球被認(rèn)為可比常規(guī)二維 (2D) 細(xì)胞培養(yǎng)更有效地模擬腫瘤行為，因?yàn)樗鼈兣c腫瘤非常相似，同時(shí)包含表面暴露和深埋的細(xì)胞、增殖和非增殖細(xì)胞，并包含具有一個(gè)充分氧化的細(xì)胞外層和缺氧中心。此類 3D 細(xì)胞球模型已成功用于環(huán)境篩選以鑒定潛在癌癥治療方法。開發(fā)可靠細(xì)胞球檢測(cè)的一些挑戰(zhàn)：

• 定位并聚焦于每個(gè)孔中的細(xì)胞球，以便在單個(gè)視野中對(duì)其進(jìn)行成像

•  優(yōu)化化合物和染色處理，以確保染料滲透并避免干擾細(xì)胞球的放置

• 在整個(gè)3D 結(jié)構(gòu)中采集代表性圖像，盡可能減少成像平面上方和下方的離焦或背景信號(hào)

•  快速分析圖像以產(chǎn)生有意義的結(jié)果，從而得出結(jié)論

優(yōu)勢(shì)

•  以20x 放大倍率在一個(gè)視野中捕獲整個(gè)細(xì)胞球

•  以96 孔或384孔形式篩選生物相關(guān)的 3D 細(xì)胞球

•  使用共聚焦成像精確檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)答

• 通過僅保存Z平面圖像的2D重構(gòu)來(lái)節(jié)省存儲(chǔ)空間

細(xì)胞球形成和處理

我們使用以下方法從癌細(xì)胞系 HCT116, DU145 和 HepG2 中形成細(xì)胞球。將細(xì)胞在 37°C 和 5% CO2 的燒瓶中培養(yǎng)，然后分離并接種到 96 或 384 孔黑色板中，孔底為透明底部 U 形孔（分別為 Corning 4520 和 3830），密度為 1000-1500 個(gè)細(xì)胞/孔，在適當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充胎牛血清 （FBS）。在 24 小時(shí)內(nèi)，每個(gè)孔底部形成單個(gè)細(xì)胞球，并在 37°C 和 5% CO2 條件下 繼續(xù)生長(zhǎng)2-4 天，直至用于實(shí)驗(yàn)（圖 1）。細(xì)胞球的培養(yǎng)時(shí)間可能更長(zhǎng)，但大小的增加可能會(huì)阻礙染色滲透和中心大多數(shù)細(xì)胞的成像。本應(yīng)用說(shuō)明描述了用于確定抗癌化合物作用的測(cè)定方法：依托泊苷、紫杉醇和絲裂霉素 C。細(xì)胞球處理首先將 10 倍濃度的化合物添加到孔中，然后孵育 1-4 天，具體取決于正在研究的機(jī)制。較短的時(shí)間用于研究細(xì)胞凋亡，較長(zhǎng)的時(shí)間用于多參數(shù)細(xì)胞毒性研究。對(duì)于超過 2 天的藥物治療，化合物每 2 天以 1 倍濃度更新一次。 

細(xì)胞球染色和成像

此處顯示的示例來(lái)自開發(fā) HCT116 細(xì)胞球測(cè)定法，用于評(píng)估除孔中凋亡細(xì)胞發(fā)生率外的細(xì)胞球形態(tài)變化。化合物處理完成后，將染色劑以 4-6 倍濃度合并成單一混合物，并直接添加到孔中的培養(yǎng)基中。選擇免洗染色劑以避免干擾細(xì)胞球。

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)以 10X或 20X的放大倍率觀察細(xì)胞球。為了分析整個(gè) 3D 結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞應(yīng)答，從細(xì)胞球體內(nèi)的不同深度收集圖像，以創(chuàng)建圖像的“堆棧”。然后使用數(shù)學(xué)算法將該圖像堆棧組合或“折疊”成單個(gè) 2D 投影圖像。在這種情況下，使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件的最大投影算法生成折疊圖像，該算法可使堆疊中的像素保持最亮的強(qiáng)度以生成投影（圖 2）。

ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)可生成更清晰的圖像，以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的分割

共聚焦光學(xué)器件能夠?qū)Ρ葘拡?chǎng)光學(xué)器件更薄的細(xì)胞球光學(xué)切片進(jìn)行成像。這可顯著減少被采集平面上方和下方的熒光發(fā)射物體產(chǎn)生的背景模糊。它還允許在亞細(xì)胞層面或在彼此聚集或堆疊的細(xì)胞之間更好地解析精細(xì)細(xì)節(jié)，因?yàn)樗鼈兲幱?/span> 3D 結(jié)構(gòu)中。使用共聚焦圖像通常可實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的分割。在使用細(xì)胞球的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，寬場(chǎng)圖像的細(xì)胞核分割比共聚焦圖像中計(jì)數(shù)的細(xì)胞核低約 20%（圖 3）。

圖 1：在高通量篩選環(huán)境中檢測(cè)細(xì)胞球的工作流程 單個(gè)細(xì)胞球可在 96 或 384 孔板中生長(zhǎng)，用化合物處理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，還可以固定細(xì)胞球。（右）使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)上的延時(shí)采集在 63 小時(shí)內(nèi)拍攝 HCT116 細(xì)胞的透射光圖像，以顯示細(xì)胞球的形成（10 倍物鏡）。

圖 2.  在橫跨細(xì)胞球深度約一半的 z 平面中采集共聚焦圖像堆疊（左）。在任何給定平面上，只有細(xì)胞球的某些細(xì)胞處于焦點(diǎn)中，因此，為了便于分析，圖像被折疊成單個(gè) 2D 圖像，以組合焦點(diǎn)內(nèi)區(qū)域（右）。

使用凋亡檢測(cè)篩選抗癌藥物

一類抗癌藥物靶向細(xì)胞凋亡的外在途徑，以觸發(fā)細(xì)胞死亡。為了展示細(xì)胞凋亡的測(cè)定，用 4 種不同抗癌化合物的系列稀釋處理在 96 孔板中培養(yǎng) 3 天的 HCT116 細(xì)胞球 24-48 小時(shí)。化合物處理完成后，使用 Life Technologies 的 CellEvent Caspase 和 MitoTracker Orange 試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將包括 Hoechst 核染料在內(nèi)的 4 倍混合染料添加到孔中的培養(yǎng)基中。選擇免洗染料以避免干擾細(xì)胞球（圖 4）。 

圖 3.  （頂部）使用寬場(chǎng)光學(xué)器件拍攝的 HCT116 細(xì)胞球的 15 張圖像的Best focus投影。軟件分割計(jì)數(shù) 817 個(gè)細(xì)胞核。 

由于細(xì)胞球邊緣的失焦熒光和中心檢測(cè)不佳的較暗的細(xì)胞導(dǎo)致失真，因此細(xì)胞核被遺漏。（底部）使用共聚焦光學(xué)器件拍攝的 HCT116 細(xì)胞球的 15 張圖像的Best focus投影。計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確，共1078 個(gè)細(xì)胞核。

用于多參數(shù)凋亡檢測(cè)

的染色劑                目的              最終濃度

圖 4.  （頂部）用化合物處理的 96 孔板中 HCT116 細(xì)胞球的圖像縮略圖的蒙太奇，以 10X Plan Fluor 物鏡成像。Hoechst 染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）被 CellEvent Caspase 3/7 凋亡標(biāo)記物（綠色）覆蓋。未處理的對(duì)照在第 4 列，Caspase 3/7 應(yīng)答在第 5-7 列明顯，其中紫杉醇在A 行從 1 μM 按 1：3 的比例連續(xù)稀釋（3個(gè)交叉重復(fù)）。（左）將十一個(gè) z 平面合并為 2D 最大投影圖像，并使用簡(jiǎn)單的自定義模塊進(jìn)行分析。原始圖像展示了低水平和高水平的細(xì)胞凋亡及其相應(yīng)的分割掩膜（寶藍(lán) = 胞核，粉色 = 凋亡細(xì)胞）。（右）通過標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞凋亡量與未處理的細(xì)胞球相比并繪制圖表，可以看出紫杉醇（綠線）在比絲裂霉素 C 或依托泊苷低得多的濃度下誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

圖 5.  抗霉素A 對(duì)線粒體的毒性作用。（左圖）Hoechst（藍(lán)色）和 MitoTracker（橙色）細(xì)胞球的疊加圖像，經(jīng) 1、22、67 和 200 nM 濃度遞增的抗霉素 A 處理。（右）細(xì)胞球內(nèi)識(shí)別的線粒體平均強(qiáng)度值圖說(shuō)明了藥物的作用。

在篩選中對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行多重檢測(cè)

在上面的凋亡篩選中，線粒體膜電位也可以通過將 MitoTracker Orange 添加到染料混合物中來(lái)評(píng)估?；蛘?，可以單獨(dú)研究通過影響線粒體代謝來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物。下文展示了使用抗霉素 A 進(jìn)行的測(cè)定，抗霉素 A 是線粒體膜電位的一種有效干擾物。經(jīng)過 4 小時(shí)處理后，根據(jù)細(xì)胞球內(nèi) MitoTracker Orange 的強(qiáng)度可檢測(cè)到線粒體健康。MitoTracker 要么沒有全部穿透到大細(xì)胞球的中心，要么中央的細(xì)胞沒有健康的線粒體，正如圖像中線粒體波長(zhǎng)通常呈調(diào)暗的內(nèi)部所指出的那樣（圖 5）。

迅速篩選微孔板中的3D細(xì)胞球

體內(nèi) 3D 培養(yǎng)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大小一致的人癌細(xì)胞球，并且能夠使用自動(dòng)化高通量、高內(nèi)涵成像篩選細(xì)胞球?qū)χ委煹姆磻?yīng)，這是促進(jìn)化療候選藥物進(jìn)行更相關(guān)檢測(cè)的重要步驟。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件可對(duì)微孔板中的 3D 細(xì)胞球進(jìn)行快速成像和分析，以監(jiān)測(cè)抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡和線粒體毒性。

有關(guān)優(yōu)化這些細(xì)胞球篩選檢測(cè)的采集參數(shù)的更多信息，請(qǐng)參閱論文：

Sirenko, O. et al., High-Content Assays

for Characterizing the Viability and Morphology of 3D

Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development

Technologies, 2015 In Press.