簡介

神經系統對許多化合物、環境因素和某些天然物質的毒性作用非常敏感。在脊髓損傷、卒中或創傷性腦損傷等病理過程中，神經毒性可導致大腦或周圍神經系統發生損傷。它也是阿爾茨海默病和帕金森病等神經退行性疾病的一個主要因素。

使用人源誘導多能干細胞 (iPSCs) 進行高內涵成像可用于檢查候選藥品或環境污染物的神經營養、神經保護或神經毒性作用。本說明展示了使用 iPSCs 和 Molecular Devices 系統和軟件通過自動化終點和活細胞檢測進行神經元毒性篩選。

優勢

•   通過真正自動化的采集和分析進行設置且無人值守

•    即時量化每個神經元的多個表型特征

•    監測活細胞數分鐘或數天的實時毒性

基于iPSC 的毒性篩選

iPSC 對神經元毒性研究非常有用，因為它們表現出成熟神經元的功能和行為，并且可用數量眾多。此具有生物相關性的細胞類型與高內涵成像和分析結合使用使得神經毒性檢測對于篩選先導化合物非常有價值，并有可能降低臨床前開發成本和對動物實驗的需要。使用來自 Cellular Dynamics International 的分化人iPSC 源性iCell 神經元開發了所展示的示例檢測。

定量神經元網絡的完整性

高內涵分可在 96 或 384 孔板中形成神經元網絡 3-5 天，然后用有毒化合物進行 48-72 小時的挑戰。在 ImageXpress Micro 系統上使用針對 ß-微管蛋白的標記抗體對神經元網絡進行可視化。使用 MetaXpress高內涵圖像采集和分析軟件中的神經突生長應用模塊進行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內涵信息學軟件分析數據。 

神經突生長應用模塊可發現有或沒有核復染的細胞體，通可在 96 或 384 孔板中形成神經元網絡 3-5 天，然后用有毒化合物進行 48-72 小時的挑戰。在 ImageXpress® Micro 系統上使用針對 ß-微管蛋白的標記抗體對神經元網絡進行可視化。使用 MetaXpress® 高內涵圖像采集和分析軟件中的神經突生長應用模塊進行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內涵信息學軟件分析數據。 

神經突生長應用模塊可發現有或沒有核復染的細胞體，通過細胞體的存在確定陽性神經元細胞，并識別從這些細胞延伸的熒光標記的神經突。幾個參數可表征神經元網絡，包括神經突數量、生長長度以及每個細胞或每個視野的分支數量。然后可以計算每個孔中細胞數量和表型的統計數據。

圖 1：神經突生長應用模塊結果。頂部：使用神經突生長應用模塊產生的圖像分析掩膜的對照和高劑量孔。標記為 ß -微管蛋白 III（綠色）的神經突和細胞核（藍色）。左下角：總生長的細胞毒性化合物的劑量-反應曲線。右下角：根據總生長曲線計算 IC50 值。 

評估線粒體膜電位

線粒體去極化已被證明是缺氧損傷或細胞毒性的早期征兆，可使用 JC-10 染料監測線粒體膜電位（圖 2）。在健康細胞中，JC-10 以橙色 J-聚集體的形式在線粒體中蓄積。隨著內膜電位的損失，JC-10 的單體形式被釋放到細胞質中，發出綠色熒光。

神經元用 JC-10 染色，并暴露于抗霉素A或纈氨酸霉素30分鐘，抗霉素A或纈氨酸霉素是導致氧化呼吸中斷和Ca2+超載的化合物。MetaXpress軟件中的顆粒度模塊可根據高于背景的強度和顆粒對象的大小進行定制以識別線粒體。將結果標準化為視野中的細胞計數。

監測活細胞毒性

可使用細胞活力染料Calcein AM 和 Hoechst 細胞核染料組合對活細胞進行毒性檢測。使用 帶有能夠維持孔板溫度、CO2 和濕度水平的環控裝置的ImageXpress Micro 系統測試了許多已知的神經毒性和無毒性化合物（圖 3）。觀察到的這些化合物的神經毒性活性與體內或臨床數據相關，從而證實了該測定法可用于預測性神經毒理學的可能性。

由于 Calcein AM 除對活神經元的細胞體外，還對神經元延伸進行染色，因此使用神經突生長應用模塊對神經元網絡進行分析，并且使用細胞分類應用模塊通過 Calcein AM 染色和核大小來識別活神經元和死神經元。

圖 2.  經抗霉素A處理的神經元。頂部：對照神經元和經抗霉素A 處理并用 JC-10 染色的神經元的圖像。使用 20X 物鏡采集顯示的圖像。底部：通過每個細胞的平均總線粒體/顆粒來測定劑量反應。

圖 3.  甲基汞對神經元的影響。頂部：顯示甲基汞對神經元的劑量依賴性毒性作用的圖像。Calcein AM 的存在表示活細胞的代謝（綠色）。左下角：通過神經突生長確定細胞毒性化合物的 IC50 曲線，并通過核大小評估細胞毒性。右下角：Hoechst 染色細胞核為偽彩紅色。

用于神經元毒性篩選的完整解決方案

Molecular Devices 利用 ImageXpress Micro 系統、MetaXpress 軟件和 AcuityXpress 軟件為在篩選環境中評估神經元毒性提供完整的解決方案。我們的活細胞選項與復雜的表型圖像分析相結合，可在藥物開發的早期階段識別毒性化合物。