簡介

人們對使用更復雜、更具生物相關性和預測性的細胞水平平臺來開發檢測和篩選化合物的興趣日益增加。StemoniX® microBrain® 3D Assay Ready 板是一個高通量 3D 培養平臺，更接近于天然的人類大腦皮層組織的發育和構成。每個細胞球均由活性皮質谷氨酸和 GABA 能神經元的混合物組成，這些神經元與來自單個供體來源的星形膠質細胞共同成熟。這種平衡的細胞混合物允許開發富含突觸的神經網絡，從而形成一個功能強大的神經元電路。microBrain 3D 細胞球中的神經細胞具有生理活性，自發性、同步神經元活性可作為鈣振蕩進行檢測。

在 FLIPR® Tetra 高通量篩選系統上使用快速動力學熒光成像來測量神經球的鈣振蕩模式和頻率，通過鈣敏感染料監測細胞內鈣水平的變化。測試了一組已知的神經調節劑，包括 NMDA、GABA 和 AMPA 受體的激動劑和拮抗劑，以及花生酸、鎮痛藥和抗癲癇藥。隨著振蕩模式的抑制或激活，觀察到變化，并與每種神經調節劑的預期效應相關。

我們還測試了一系列神經毒性化合物，包括選定的殺蟲劑和阻燃劑，并證明了該檢測對化合物效應的敏感性。該檢測經過優化，可在 384 孔板中進行高通量篩選，并可通過使用 ScreenWorks Peak Pro軟件進行多參數分析來表征神經細胞球中的振蕩曲線。

自動測量的讀數包括振蕩速率、峰值頻率、峰值寬度、振幅和波形不規則性。

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像系統，通過高內涵成像評估化合物處理對細胞活性和線粒體完整性的潛在影響。測定了不同化合物對 Ca2+ 振蕩速率或細胞活性的影響的 EC50 值。在此，我們證明了使用人 iPSC 源性細胞形成的 3D 神經細胞球的功能和形態測定可用于評估候選藥物，以及使用鈣振蕩和高內涵成像進行神經毒性評估。

優勢

利用更接近體內環境的高通量 3D 培養平臺

表征神經元功能和細胞毒性測定

使用功能、結構和末端終點評估候選藥物并評估神經毒性

材料

•       StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384 孔板（StemoniX，cat.  #BSARX-AA-0384）

•       Sorvall 離心機

•       FLIPR 鈣 6 試劑盒（Molecular Devices，cat.  #R8190）

•       活性染料 Calcein AM（Invitrogen，cat.  #C3100MP）

•       線粒體電位染料 MitoTracker Orange（Invitrogen，cat.  #M7510）

•       Hoechst 核染料（Invitrogen，cat.  #H3570）

•       配備 ScreenWorks Peak Pro 軟件的 FLIPR Tetra 系統（Molecular Devices）

•       ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像系統與 MetaXpress 高內涵圖像采集和分析軟件（Molecular Devices）

利用更復雜、更具生物相關性和預測性的細胞平臺

StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384孔板由 StemoniX， Inc. 提供。 高通量 3D 培養平臺與天然人腦組織的發育和組成更相似。在該平臺中，直徑約 600 μM  的人 iPSC 源性神經細胞球由生理學上相關的功能活性皮質谷氨酸和 GABA 能神經元（通過 MAP2 識別；綠色）和星形膠質細胞（通過 GFAP 識別；紅色）共同培養組成，如圖 1 所示。這種平衡的細胞混合物允許開發富含突觸的神經網絡，從而形成一個功能強大的神經元電路。microBrain 3D 細胞球中的神經元細胞具有生理活性，具有自發的、同步的、易于檢測的鈣振蕩。該高級神經平臺已針對 384 孔板中的高通量篩選進行了優化，并在不同的孔和板中顯示出高度一致的功能表現。

圖 1：明場和免疫染色 StemoniX microBrain 3D 細胞球。A） 明場圖像。B） 免疫染色細胞球顯示活性皮質谷氨酸和 GABA 能神經元通過 MAP2 識別；綠色，星形膠質細胞通過 GFAP 識別；紅色，細胞核通過 DAPI 識別；藍色。使用 ImageXpress Micro Confocal共聚焦系統采集圖像。

方法

設置 3D 神經培養物

StemoniX microBrain 板在常溫條件下預裝。每個孔包含單個大小統一的人 iPSC 源性皮質神經細胞球，成熟 8-12 周。在到達當天，將板以 200 x g 離心 5 分鐘，用顯微鏡檢查以確認細胞球沉降到板孔底部，用 70% 乙醇進行除污，不要密封。之后，更換培養基（1/2 體積，三次），將孔板置于 37°C、5% CO2 培養箱中 5-7 天。每兩天進行一次培養基更換。

工作流程圖如圖 2 所示。首先使用透射光對孔進行成像，以驗證是否存在細胞球。接下來，將細胞球與 FLIPR 鈣 6 染料一起孵育，并在 FLIPR Tetra 系統上對鈣振蕩進行成像。然后，將細胞與化合物進一步孵育，并染色以測定活性，在 ImageXpress Micro Confocal 系統上進行分析。

使用鈣流測定法評估對鈣振蕩的早期影響

 如 Sirenko、Grimm 等人 在20171 年所描述的，使用FLIPR Calcium 6試劑評估神經元胞內Ca2+流。使用 FLIPR Tetra 系統，在 470-495 nm 激發 10 分鐘后，以 8 Hz 的頻率在 515-575 nm 處測定細胞內 Ca2+ 流動力學。每次讀取的曝光時間為 0.05s，增益設置為 2000，激發強度設置為 30%。儀器溫度保持在 37°C 恒定。 在初次接觸化學品后 60 分鐘測量對鈣振蕩的早期影響。對于早期時間點，在添加化合物之前，用 FLIPR 鈣 6 染料預染細胞兩小時。通常在添加化合物之前測量不含化合物的鈣振蕩的基線。對于 24 小時實驗，在添加 FLIPR 鈣 6 染料之前，將細胞暴露于適當濃度的化學品中 22 小時。再添加 FLIPR 鈣 6 染料（4 倍濃度）兩小時，添加額外體積的化合物以保持化合物濃度相同。定量數據評估，代表性的數據使用 ScreenWorks 軟件可得出峰值計數（每 10 分鐘）、平均峰值振幅、平均峰值寬度（振幅為 10%）、平均峰值間距（峰值之間的時間）、平均峰值上升時間（振幅為 10% 至 90%）和平均峰值衰減時間（振幅為 90% 至 10%）等描述。

對活細胞進行染色以評估表型變化

使用三種染料對活細胞進行染色：活性染料 Calcein AM （1 pM）、線粒體電位染料 MitoTracker Orange （0.2 pM） 和 Hoechst 核染料 （2 pM）。為了評估神經特異性標記物，用 4% 甲醛 （Sigma） 固定細胞，并用抗MAP2 和抗 GFAP 抗體 （BD Biosciences） 染色。

使用高通量 3D 成像和分析評估神經毒性

使用帶有 10X Plan Fluor 物鏡的 ImageXpress Micro Confocal 系統對細胞球進行成像。細胞球檢測的方法和采集設置如前所述2。從孔底開始采集由 10-15 μm 分隔的 19 張圖像的 z 堆棧，并向上移動以覆蓋每個細胞球的光穿透部分（深度約 100-150 μm）。所有單個圖像均被保存并用于 3D 分析和 2D 投影（最大投影）分析。使用 MetaXpress® 高內涵圖像采集和分析軟件中的自定義模塊編輯器分析圖像。分析方法之前已在 Sirenko， Mitlo 等人于20152 年進行過描述。使用在 MetaXpress 自定義模塊編輯器中創建的程序生成針對其他多參數輸出的自定義分析。首先，自定義模塊分析識別出細胞球。其次，活細胞數量通過 Calcein AM 信號的存在來識別。第三，通過 MitoTracker Orange 染色檢測具有完整線粒體的細胞數量。死細胞通過 Calcein AM 信號的缺失或降低來識別。類似方法可用于 3D 圖像分析，以評估 3D 中的神經毒性和測量值推導，如 Sirenko、Hancock 等人 20163 年所描述的。

圖 2. 利用 3D 培養平臺進行動力學和細胞成像分析的多參數工作流程。1） StemoniX microBrain® 3D Assay Ready 384孔板經過培養，然后在 ImageXpress Micro 共聚焦系統上使用透射光觀察。2） 將細胞球與鈣敏感染料和神經毒性化合物一起孵育。藥物處理時，在 FLIPR Tetra 系統上分析振蕩速率的變化。3） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統對染色的細胞進行功能和活性篩選。

結果

神經調節劑對鈣振蕩的影響

microBrain 3D 細胞球中的神經元細胞產生自發的、同步的鈣振蕩。我們在 FLIPR Tetra 系統上使用動態熒光成像來測量神經細胞球 Ca2+ 振蕩的模式和頻率，通過孵育兩小時后 FLIPR 鈣 6 染料的細胞內 Ca2+ 水平變化進行監測。測試了一組已知的神經調節劑，包括激動劑和拮抗劑NMDA、GABA 和kainate 受體。用化合物孵育一小時后，在 10 分鐘內測定細胞球的鈣振蕩頻率。來自其中六種化合物的振蕩模式如圖3A所示。注意與對照相比，振蕩模式的差異。IC50 值和每種化合物的作用機制如圖 3B 所示。

圖 3. 神經活性化合物的評估。A） 在 FLIPR Tetra 系統上評估 10 分鐘內鈣振蕩的樣本軌跡。用 FLIPR 鈣 6 染料處理細胞球兩小時，并用化合物處理一小時。B） 作用機制和 IC5o 值根據 10 分鐘內峰值速率的濃度反應曲線確定，采用 4 參數曲線擬合。

神經毒性效應評估

許多工業和環境化學品都報告了對人體的神經毒性作用。此處描述的方法可用于通過評估鈣振蕩模式和細胞活性的變化來篩選化合物的潛在神經毒性。為了評估神經毒性作用，將神經細胞球與幾種已知的神經毒性化合物一起孵育 24 小時，然后加入 FLIPR 鈣 6 染料兩小時。

在 FLIPR Tetra 系統上測量鈣振蕩。數據子集如圖 4 所示。與對照相比，神經毒性化合物引起鈣振蕩模式擾動。具體而言，對于用指定化合物處理的樣品，觀察到峰值頻率降低或信號振幅明顯更小。

圖 4. 評估殺蟲劑、工業化合物和阻燃化合物的神經毒性作用。A） 由 FLIPR Tetra 系統評估的 10 分鐘內的樣品軌跡。將一組選定的神經毒性化合物與 iPSC 源性 microBrain 神經細胞球一起孵育 22 小時。FLIPR 鈣 6 染料與細胞和化合物一起再孵育兩小時。在 10 分鐘內記錄鈣振蕩。B） 該表列出了化學類別和 IC50 值，這些值根據 10 分鐘內使用 4 參數曲線擬合的峰值速率的濃度反應曲線確定。

使用高內涵成像評估細胞活性和線粒體完整性

共聚焦成像和 3D 圖像分析方法用于表征化合物對 3D 神經細胞球形態和活性的影響。為了評估細胞毒性作用，用多種化合物處理細胞 24 小時，然后用 Hoechst 核染料、Calcein AM 和 MitoTracker Orange 染料對活細胞進行染色。然后使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統，通過 DAPI、FITC 和 TRITC 通道以及 10X 物鏡對細胞球進行成像。對照細胞球和

用環境毒素甲基汞處理的細胞球如圖 5 所示。使用 MetaXpress 軟件中的自定義模塊編輯器生成成像讀數分析。首先，分析識別出細胞球。其次，活細胞數量通過 Calcein AM 信號的存在來識別。第三，通過 MitoTracker Orange 染色檢測具有完整線粒體的細胞數量。通過Calcein AM 信號的缺失或減少來識別死細胞。

圖 5. 對照細胞球和經 1 mM 甲基汞處理的細胞球的最大投影圖像。 以藍色顯示的細胞核，以綠色顯示的Calcein AM染色，以橙色顯示的線粒體染色。下圖所示的圖像分析掩膜包括細胞球掩膜（白色）、完整線粒體染色陽性的細胞核（深藍色）、線粒體染色陰性的細胞核（紅色）和陽性細胞的細胞質（淺藍色）。在上述示例中，未經處理的細胞球中有 608 個陽性細胞（具有完整的線粒體）。在用甲基汞處理的細胞球中，陽性細胞的數量降至 228個。 

結論

總之，我們證明了神經細胞球對評估神經毒性作用有反應，并可用于評估各種化合物的神經毒性作用。我們還證明，該檢測可作為高通量檢測形式進行修改，并可用于化合物篩選。

多參數分析可提供信息豐富的讀數，從而能夠篩選測試化合物對神經元活性以及細胞形態和活力的影響。用于神經毒性評估的表型描述包括鈣振蕩峰計數、振幅、間距和峰寬，以及 Calcein AM 或 MitoTracker Orange 陽性的細胞數量。可針對不同的讀數計算化合物的有效濃度，然后根據化合物的潛在神經毒性危險對其進行排序。該方法用于評估化合物庫中的化合物的毒性作用，該庫包含不同類別化學品的代表性實例，包括藥物、殺蟲劑、阻燃劑和多芳香烴。

參考文獻：

1.       Sirenko, O., Grimm, F. A., Ryan, K. R., Iwata, Y., Chiu, W. A., Parham, F., Wignall, J. A., Anson, B., Cromwell, E. F., Behl, M.,et al. (2017). In vitro cardiotoxicity assessment of environmental chemicals using an organotypic human induced pluripotent stem cell-derived model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 322, 60–74.

2.       Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., and Cromwell, E. F. (2015). High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13, 402–414.

3.       Sirenko, O., Hancock, M. K., Hesley, J., Dihui, H., Avrum, C., Jason, G., Carlson, C. B., and Mann, D. (2016). Phenotypic characterization of toxic compound effects on liver spheroids derived from iPSC using confocal imaging and three-dimensional image analysis. Assay Drug Dev. Technol. 14, 381–394.

For additional information, please refer to the following papers

·       Sirenko, O., Parham, F., Dea, S., Carromeu, C., et.al (2018). Functional and Mechanistic Neurotoxicity Profiling Using Human iPSC-Derived Neural 3D Cultures. Toxicological Sciences 167(1).

·       Anson, B. D., Kolaja, K. L., and Kamp, T. J. (2011). Opportunities for use of human iPS cells in predictive toxicology. Clin. Pharmacol. Ther. 89, 754–758.

·       Camp, J. G., Badsha, F., Florio, M., Kanton, S., Gerber, T., WilschBräuninger, L. E., Sykes, A., Hevers, W., and Lancaster, M. (2015). Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 15672–15677.