準備細胞:
1、檢查并確認細胞沒有真菌、細菌、支原體污染。
2、凍存前的細胞處于對數生長期最佳。
3、計數待凍存的細胞數量。懸浮細胞應 180g 離心 5~10min 后除去培養基,貼壁細胞應消化后計數,再 180g 離心除去培養基以獲得細胞沉淀。
細胞凍存:
1、首先確定細胞適宜的凍存密度和體積,計算應使用的本凍存液體積。
注意:可使用的凍存密度為 2~40×106 /ml,最佳密度為 4~20×106 /ml。凍存體積為 0.25~1ml/管,推薦凍存體積為 0.5ml/管。
2、吸取適量 凍存液 重懸細胞,立即分裝至細胞凍存管。
3、立即將凍存管移入-80℃低溫冰箱,不能采取任何程序降溫措施或使用程序降溫裝置。如果無法立即移入-80℃低溫冰箱,至少應當先移入 0℃以下環境中(如-20℃冰箱)短暫存放 10 min 左右,同樣不能采取程序降溫。凍存液重懸后的細胞不能在室溫或 2~8℃靜置超過 10 min 以上。
4、-80℃冰箱過夜后的凍存管,要立即移入液氮中儲存,不可于-80℃長期凍存。
細胞復蘇:
1、先準備室溫或 37℃預溫的基礎培養基,其體積為凍存液體積的 15~30 倍。
2、取出液氮中的凍存管,置于 37℃水浴并不斷輕搖。待剩余 1 粒米大小的冰塊時,迅速移出水浴。3、立即用基礎培養基稀釋細胞懸液,輕柔吹打 3~5 次混勻。然后,180g 離心 5~10 分鐘,獲得細胞沉淀備用。
4、加入適量新鮮培養基,使用移液管緩慢懸浮細胞,并將細胞轉染細胞培養皿/瓶中,顯微鏡下觀察細胞狀態,放入細胞培養箱中培養。
5、24h 后觀察細胞狀態,并更換新鮮細胞培養液。