一、概述
類器官污染是一個老生常談的事情，尤其是做胃腸道，組織本身帶來的菌群數量非常龐大，一旦消毒不到位，就會導致類器官培養失敗。上一期我們學習了類器官污染鑒別與除菌攻略（一），接下來小愛帶大家了解類器官原代培養無菌預防及細胞房除菌方案（二）。
二、原代培養無菌預防
1、預防無菌各個環節
2、取樣及保存無菌預防
注意無菌性：
1）為預防污染，可在組織保存液(abs9784)中加入1%雙抗(abs9244)；
2）組織保存液體積要能浸沒整個組織，一般5-10mL；
3）取樣瓶要保證無菌，也可以用15mL或50mL無菌離心管當取樣管；
4）用酒精棉消毒過的鑷子將組織放入含有組織保存液的取樣瓶中；
5）手術切除的組織需立即轉入含有組織保存液無菌取樣瓶中。
保存及運輸條件：
1）4℃保存，冰袋運輸；
2）越早做，成功率越高，當天做最佳，最晚不超過48h。
3、原代培養試劑抗生素添加指南
貨號-規格 | 抗生素 | 組織保存液 | 緩沖液 | 組織消化液 | 類器官培養基 |
abs9246-100mL | 青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(100×三抗) | 稀釋1:50 | 稀釋1:25 | 稀釋1:50 | 稀釋1:100 |
abs42018967-10mL | 硫酸慶大霉素溶液(10mg/mL) | 稀釋1:100 | 稀釋1:50 | 稀釋1:100 | 稀釋1:200 |
備注：
三抗：青霉素10kU/mL，鏈霉素10mg/mL，兩性霉素B25µg/mL。工作濃度稀釋100X：青霉素100U/mL，鏈霉素100ug/mL，兩性霉素B 0.25µg/mL。
慶大：10mg/mL。工作濃度200X—20000X：0.5ug/ml-50ug/mL
4、細胞房著裝要求
操作細胞培養物前后應洗手。穿戴個人防護設備不僅可保護您免受危險品污染，還可降低皮屑以及衣服上污物和灰塵污染培養物的可能。
正確的穿衣順序：
1）換專用鞋
2）無塵手套（避免不潔的雙手經穿著時沾附于無塵衣上）
3）網帽（帶網帽時須確保頭發不可暴露于網帽外，之后戴口罩遮住口鼻）
4）無塵服（不要穿棉質衣服(脫落纖維)
5）鞋套
5、超凈臺試劑布局
適合慣用右手的工作人員的工作臺基本布局。慣用左手的工作人員可相應地調整工作臺面上物品的擺放位置(圖源網絡)
超凈工作臺或安全柜里的物品擺放一般遵循以下右手試用習慣，并可根據特殊實驗中增加物品進行相應的改動。
1）在工作臺中部開闊區域放置細胞培養容器；
2）移液器置于右前方易于取用的地方；
3）試劑和培養基置于右后方，便于吸取；
4）試管架置于中后部，用于固定其他試劑；
5）小型容器置于左后部，用于盛放廢液。
6、人為操作技巧
1）小心取用無菌實驗物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝下放置桌面。
2）每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同也不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以75%酒精擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10min以上后，再進行下一個細胞株之操作。
3）離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標記筆標示內容物名稱、操作日期、操作人員姓名。若是細胞傳代培養，更需注明目前的代數，以及這是同一代中的第幾盤。
三、細胞房除菌方案
細胞房主要做好清潔和消毒工作，小愛匯總了目前細胞房常用的消毒試劑種類及作用原理，供大家了解。
除菌劑種類及作用原理
種類 | 作用原理 | 特點 |
醇類除菌劑 | 乙醇的抗菌原理是使蛋白質變性 | 易揮發，作用時間短；刺激性；易燃 |
含氯除菌劑 | 通過新生態氧的ji強氧化性使菌體和病毒的蛋白質變性，從而使病原微生物致死。 | 刺激性；腐蝕性 |
醛類除菌劑 | 使蛋白中的氨基和巰基烷基化來滅活微生物 | 刺激性；致癌性 |
過氧化物類除菌劑 | 通過羥基的強氧化性破壞組成細菌的蛋白質 | 刺激性；腐蝕性 |
含碘除菌劑 | 通過氧化性破壞病原體原漿蛋白的活性基因，并與蛋白質的氨基結合而使其變性沉淀 | 刺激性；腐蝕性 |
酚類除菌劑 | 酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白凝集沉淀 | 刺激性；易使橡膠制品變脆變硬 |
環氧乙烷除菌劑 | 環氧乙烷與蛋白質分子發生烷基化反應 | 易燃易爆；毒性大 |
雙胍類和季銨鹽類除菌劑 | 破壞細菌的細胞膜，增加細菌胞漿膜通透性，使菌體胞漿物質外滲 | 無刺激性；無腐蝕性；可生物降解 |
1、儀器設備、物體表面除菌方案
適宜微生物增殖的主要條件是溫暖潮濕的地方，比如培養箱、水盤、水浴鍋等，常用的除菌劑如下所示：
培養箱除菌劑(abs9372-480mL)
培養箱除菌劑特點：
廣譜高效：專門用于清除CO2培養箱內的細菌、真菌及支原體等微生物污染；
安全性高：無刺激，無腐蝕，不揮發；
使用方便：直接噴灑即可，省時省力。
用法：
1、移除細胞后，直接對細胞培養箱的隔板、內壁噴灑適量，也可倒出少許，將脫脂棉球浸泡后擦拭使用；
2、建議一周處理一次，配合培養箱水盤除菌劑使用效果更佳。遇污染爆發時期，如梅雨季節等，可適當增加用量。
細胞房除菌劑(abs9373-480mL)
細胞房除菌劑特點：
具有很強的抑菌功能，可用于細胞房的污染控制，通過清除細胞房內細菌、真菌及其孢子，可有效防止細胞的污染，從而減少由于細胞污染帶來的人力、財力、時間方面的浪費。
用法：
1．直接對細胞房的死角、墻面、空間進行噴灑，也可倒出少許，將脫脂棉球浸泡后擦拭使用。 建議一周處理一次，配合紫外線使用效果更佳。
2．建議每立方米(m3)使用量為5-8mL，如10m2、高3m的房間推薦用量為150mL。遇污染爆發時期，如梅雨季節等，可適當增加用量。若室內墻壁上有霉菌生長，可噴灑于墻壁表面，或者用浸泡后的棉球擦拭。
水盤抑菌劑(abs9374-20mL)
水盤抑菌劑特點：
用來消毒培養箱中的水盤，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無毒；對不銹鋼無腐蝕性；不揮發。
用法：
1）建議每周進行一次系統地清潔和消毒培養箱水盤。
2）稀釋100倍即可使用，即將1升水中加入10mL的水盤抑菌劑。
水浴鍋抑菌劑(abs9371-100mL)
水浴鍋抑菌劑特點：
用來消毒水浴鍋，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1）建議每周進行一次系統地清潔和消毒水浴鍋。
2）稀釋500倍即可使用，即將1升水中加入2mL的水浴鍋防菌劑。
2、細胞房空氣消毒方法
空氣污染不容小覷，氣溶膠污染也是細胞房常見的污染途徑，小愛整理了常見的空氣消毒方法如下：
滅菌方法 | 作用原理 | 特點 |
紫外線燈殺菌 | 波長在260nm的殺菌力ZUI強，紫外線作用于細胞DNA | 穿透力差；有死角；致癌 |
臭氧滅菌 | 通過臭氧分解的單個氧原子的強氧化性破壞細菌的胞膜蛋白 | 滅菌che底；殘留性小；費用較為昂貴 |
空氣過濾(恒溫恒濕裝置) | 逐次使用不同孔徑的濾膜將微生物過濾干凈 | 滅菌che底；無毒；費用較為昂貴 |
3、細胞房地面消毒方法
地面是細胞房最常忽略的地方，通常，腳底帶來的微生物污染也是導致細胞房污染爆發的關鍵因素之一，小愛整理了常用的地面清潔劑，供大家參考。
滅菌劑 | 作用原理 | 特點 |
84消毒液 （次氯酸鈉） | 次氯酸鈉的水解產物次氯酸進一步分解 形成新生態氧[O]，新生態氧的ji強氧化性 使菌體和病毒的蛋白質變性 | 滅菌,che底；殘留性小；有腐蝕； 與氨或酸(如潔廁靈)混合時易釋放出 有毒氯氣 |
新潔爾滅 （苯扎溴銨） | 季銨鹽類消毒劑屬于陽離子表面活性劑， 能吸附帶陰離子的細菌并破壞細菌的細胞膜， 增加細菌胞漿膜通透性。 | 可殺滅常見細菌、真菌；刺激性低； 無腐蝕； |
來蘇爾 （甲酚） | 酚類可裂解并穿透細胞壁，使菌體蛋白 凝集沉淀，快速殺滅細胞。 | 可殺滅常見細菌、真菌、刺激性強， 易使橡膠制品變脆變硬 |
今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！
注：文中部分圖源于網絡，僅供學習參考用。
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貨號 | 品名 | 規格 | 貨期 |
abs9246 | 青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(100×三抗) | 100mL | 現貨 |
abs42018967 | 硫酸慶大霉素溶液(10mg/mL) | 10mL | 1-2周 |
abs9371 | 水浴鍋抑菌劑 | 100mL | 現貨 |
abs9372 | 培養箱除菌劑 | 480mL | 現貨 |
abs9373 | 細胞房除菌劑 | 480mL | 現貨 |
abs9374 | 水盤抑菌劑 | 20mL | 現貨 |
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