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概述

免疫細胞培養的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養、質量優化、后續研究。小愛已經給大家詳細介紹了《免疫細胞培養攻略之樣本制備（一）》、《免疫細胞培養攻略之細胞分選（二）》、《免疫細胞培養攻略之分型鑒定（三）》、《免疫細胞培養攻略之擴增&培養（四）》今天我們繼續一起學習質量優化的相關知識。

質量優化(Quality Optimization)：針對一些不良因素，如樣本制備成單細胞懸液時產生的細胞團塊、碎片等；細胞擴增培養時支原體和內毒素的影響，并積極采取對應的措施。

質量優化

支原體(Mycoplasma)是介于細菌和病毒之間，沒有細胞壁的原核細胞型微生物。

1、形態特征

支原體的體積很小，0.1-0.3μm，光學顯微鏡無法觀測，也無法通過0.22μm的過濾器過濾，并且傳統的抗生素對支原體一般沒有效果。支原體可寄生/共生/獨立存活于培養基中，98%吸附于細胞膜或者細胞間隙。

2、污染源

1）支原體陽性細胞的交叉污染，并且由于支原體可垂直傳染，一旦細胞發生污染，下一代細胞同樣也會存在支原體的污染；

2）實驗操作人員的口腔、唾液等等，實驗人員的操作習慣，如交叉使用培養液、防護不到位也會成為支原體的污染來源；

3）培養條件如操作環境、培養用的儀器耗材清潔或滅菌不到位也都會增加支原體污染的風險。

3、對細胞研究的影響

1）抑制細胞生長、代謝，引起死亡：一般情況下輕度的支原體污染對于細胞的生長沒有明顯的影響，但是由于消耗培養液中的營養，所以細胞的生長會變慢，支原體也可能通過感染細胞并利用其生物合成機制，抑制關鍵代謝途徑，最終導致細胞生長受阻和死亡；

2）染色體畸變，破壞核酸合成，DNA片段化：支原體可能通過與細胞核酸相互作用，引發染色體結構的變異，影響DNA合成和維持染色體完整性，如支原體感染可以模擬shRNA介導的p53敲除，允許Ras轉化，從而使p53的功能失活；

3）改變細胞膜抗原性：支原體影響參與炎癥和細胞轉化的細胞途徑，如支原體的蛋白質與TLR相互作用或進入細胞，從而改變負責炎癥和DNA修復的幾種途徑；

4）改變轉染效率：支原體可能通過影響細胞內的基因轉運和表達機制，減緩或干擾DNA的轉染效率；

5）對細胞凋亡誘導劑敏感性增加：支原體可以通過某些蛋白，調節細胞凋亡途徑中的關鍵分子，增加細胞對凋亡誘導劑的敏感性，如NAE和支原體酶MGA-0676的相互作用，誘導的DF-1細胞凋亡。

4、支原體的預防

支原體的污染防治也是很重要的，比如：日常1-2周進行支原體的檢測，對于新到的細胞株、凍存保種前、重要實驗開始前都應當進行支原體的檢測。10個預防支原體的tips大家可以保存學習噢：

1）穿戴適當的個人防護設備（手套、專用的干凈實驗服、護目鏡）并消毒手套；

2）在細胞處理開始前以及處理不同細胞系之間擦拭安全柜中的工作桌面；

3）避免在你的細胞上說話或打噴嚏；

4）避免飛濺、溢出和氣溶膠；

5）為每個細胞系使用對應的培養基瓶；

6）定期清潔培養箱，包括水盤；

7）定期清空及清潔水浴設備；

8）細胞復蘇幾天后測試新細胞培養物的支原體污染；

9）隔離所有進入實驗室的細胞培養物,直到它們經過支原體檢測；

10）不要忘記，每2周進行一次支原體的常規檢測。

表1 預防支原體污染的試劑

5、支原體的檢測方法

支原體的檢測方法也非常多，小愛也給大家整理了每種方法的原理、優缺點（下表）。

表2 支原體檢測方法的比較

表3 支原體檢測試劑盒

6、支原體的去除

目前相對有效的支原體的清除方法是使用支原體清除劑，其他的方法比如清洗純化法（利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的）或者使用支原體特異血清也可以嘗試。

表4 支原體去除試劑

內毒素

內毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，其化學本質是一種脂多糖(LPS)，其單位為EU/mg或EU/U。一個EU相當于約0.1至0.2ng內毒素/mL溶液。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞后才釋放出來。

1、特征

內毒素非常耐熱，只有在160℃，加熱2-4h，或者用強堿/強酸/強氧化劑加熱煮沸30min才能破壞其生物活性。

2、污染源

1）配制各種試劑、緩沖液的水；

2）各種培養基、血清和添加劑中“混入"；

3）塑料器具、玻璃器具等表面。

3、對細胞的影響

1）細胞功能改變：內毒素可以刺激一些細胞分泌炎癥因子，導致局部炎癥反應，如低至0.5ng/mL的內毒素處理6h就可以增加馬腹膜巨噬細胞中IL-6的分泌；

2）導致細胞亞健康： 內毒素會加速細胞衰老、凋亡，甚至死亡；

3）活化細胞：在單核細胞存在的條件下，100ng/mL內毒素可以刺激人類T細胞的增殖及其淋巴因子的產生；

4）降低真核細胞系的轉染效率：已純化質粒DNA中的內毒素可降低所有細胞系的轉染效率和活力，內毒素含量(>10EU/μg)會對標準細胞系中的轉染、蛋白質表達和活力產生負面影響。

4、內毒素的預防

1）選擇高質量/低內毒素的培養基、血清和試劑耗材，在免疫細胞的培養過程中，可以選擇免疫細胞專用的無血清培養基，如果選擇經典的培養體系，要選擇低內毒素的血清和基礎培養基；同時，免疫細胞培養的過程中添加的生長因子等也要選擇高質量低內毒素的；

2）重復使用的實驗耗材可高溫高壓處理：250℃，30min，或者180℃，3h；

3）細胞培養的水質也至關重要，無酶無菌水(abs9259)可以滿足實驗室每日15mL純水/超純水的用量，關愛每一個細胞寶寶；

4）另外可以對培養過程中自行配置的一些緩沖液進行過濾除菌，這樣可以在加入到細胞之前消除潛在的內毒素。

表5 預防內毒素的相關產品

5、內毒素的檢測

小愛也給大家整理了內毒素每種檢測方法的原理、優缺點（表6）。常用的方法是鱟試劑法和重組C因子法，由于鱟作為國家二級保護動物，目前不能再進行大規模使用。所以我們推薦大家使用重組C因子(rFC)法來檢測內毒素。

表6  內毒素的檢測方法

6、內毒素的清除

細胞培養中的內毒素暫時沒有方法可以有效去除，所以小愛建議大家做好預防，畢竟防大于治！

今天講解就到這了，下一個質量優化，我們不見不散呀！大家如有細胞培養問題，歡迎一起交流哦！

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