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標(biāo)題：Absolute Quantification of Dystrophin Protein in Human Muscle Biopsies using Parallel Reaction Monitoring (PRM)

期刊：JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY

發(fā)表時間：2019年

摘要

杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一種發(fā)病率相對較高的單基因疾病，由X染色體上編碼抗肌萎suo蛋白基因(Dystrophin)突變，導(dǎo)致無法產(chǎn)生足夠的抗肌萎suo蛋白，患者的肌肉組織逐漸被脂肪和纖維化組織取代，大約每5000名新生男嬰中就有1人患病。針對此疾病需要一種可靠和準(zhǔn)確的方法來量化人類骨骼肌活檢中的肌營養(yǎng)不良蛋白，這對于評估肌營養(yǎng)不良素替代療法在Duchenne肌營養(yǎng)不良中的療效以及深入了解肌營養(yǎng)不良水平與Becker肌營養(yǎng)不良疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系至關(guān)重要。目前測量肌營養(yǎng)不良蛋白的方法，如蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光，雖然簡單明了，但缺乏準(zhǔn)確性，有時甚至缺乏特異性。本文通過采用標(biāo)準(zhǔn)化一種靶向質(zhì)譜法，使用全長13C6-Arg、13C6、15N2-Lys標(biāo)記的肌營養(yǎng)不良蛋白和平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)來測定肌肉中肌營養(yǎng)不良素的絕對量。該方法被發(fā)現(xiàn)是可重復(fù)的，定量極限低至每毫克總肌肉蛋白30pg的肌營養(yǎng)不良蛋白。然后對該方法進(jìn)行測試，以測量來自健康捐贈者和Duchenne和Becker肌營養(yǎng)不良患者的肌肉活檢中肌營養(yǎng)不良蛋白的水平。

引言

肌營養(yǎng)不良蛋白是維持肌纖維完整性和功能的肌營養(yǎng)不良相關(guān)蛋白復(fù)合物(DAPC)的重要成員。肌營養(yǎng)不良通過DAPC將肌纖維的細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白絲連接到細(xì)胞外基質(zhì)，并在肌纖維收縮和松弛過程中穩(wěn)定肌膜。缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)，如杜氏肌肉營養(yǎng)不良(DMD)或其異常的定性和定量表達(dá)如Becker氏肌營養(yǎng)不良癥(BMD)，導(dǎo)致肌膜不穩(wěn)定和肌纖維退化。DMD患者通常在20多歲時死亡，而BMD患者存活時間更長，但疾病嚴(yán)重程度和發(fā)病率不同。肌營養(yǎng)不良蛋白的數(shù)量和質(zhì)量顯著影響肌肉穩(wěn)定性。在過去幾年中，已經(jīng)開發(fā)出了恢復(fù)DMD患者中缺失的肌營養(yǎng)不良蛋白的有希望的療法，目前正處于II期和III期臨床試驗(yàn)中。然而，使用這些療法恢復(fù)的肌營養(yǎng)不良蛋白的量還沒有很好的定義，這導(dǎo)致了關(guān)于肌營養(yǎng)不良蛋白的多少足以穩(wěn)定肌膜和改善患者預(yù)后的相互矛盾的結(jié)論。此外，肌營養(yǎng)不良蛋白水平與BMD疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系尚不清楚。量化骨骼肌組織中肌營養(yǎng)不良蛋白的準(zhǔn)確方法對于作為既可以作為評估肌營養(yǎng)不良蛋白替代療法療效的藥效學(xué)生物標(biāo)志物，也可以作為評估疾病嚴(yán)重程度的替代生物標(biāo)志物。

研究結(jié)果

01.測定SILAC標(biāo)記肌管中肌營養(yǎng)不良蛋白的絕對量

使用含有不同百分比肌營養(yǎng)不良蛋白的SILAC肌管提取物刺入骨骼肌提取物的肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)的滴定曲線來測試該方法的線性。通過在含有可變比例的正常肌提取物與DMD肌提取物的骨骼肌提取物中加入SILAC肌管提取物來生成滴定曲線，生成兩條滴定曲線以確定肌營養(yǎng)不良蛋白的線性和定量限度。

02.WB檢測肌營養(yǎng)不良蛋白滴定曲線

WB檢測結(jié)果顯示肌營養(yǎng)不良蛋白427kDa， α-肌動蛋白(100kDa)用作上樣對照，并檢查其線性關(guān)系。

研究結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，作者標(biāo)準(zhǔn)化了一種穩(wěn)健可靠的靶向質(zhì)譜法，以量化人體骨骼肌裂解物中肌營養(yǎng)不良蛋白的絕對量。研究發(fā)現(xiàn)該方法在寬動態(tài)范圍內(nèi)是線性的，并且與通過蛋白質(zhì)印跡的相對定量相比更具可重復(fù)性。該方法還可用于量化和表征肌營養(yǎng)不良蛋白基因不同突變的BMD患者肌肉中的肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)，它可以精確地將這些突變映射到蛋白質(zhì)中的必需和非必需結(jié)構(gòu)域。該方法也可用于確定未來接受不同肌營養(yǎng)不良蛋白替代療法的DMD患者中肌營養(yǎng)不良素的水平或恢復(fù)的肌營養(yǎng)不良因子。