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標(biāo)題：A beginner's guide to study extracellular vesicles in human bloodplasma and serum.

期刊：Journal of Vesicles Extracellular

發(fā)表時(shí)間：2024年1月9日

摘要

血液是獲取和研究細(xì)胞外囊泡(EVs)最為常見的體液。目前血液在臨床分析中應(yīng)用廣泛，而血液來源EVs的研究更加的復(fù)雜。在2022年由國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)在芬蘭舉辦的血液細(xì)胞外囊泡研討會(huì)上，意識到初學(xué)者研究人員可能缺乏對血液外泌體研究的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，難以在研究中避免常見的問題。本篇指南旨在解釋血液的組成和常用術(shù)語，提供了血液采集、血漿和血清制備的指南，并介紹了在考慮血液其他影響因素的情況下分離和檢測血液EVs的原理。希望通過這份指南，為初學(xué)者研究人員提供簡明、有據(jù)可依的指導(dǎo)說明，使其更好地了解當(dāng)前關(guān)于研究血液EVs的知識和可用資源。

研究內(nèi)容

一、血液組成

圖1 血液組成示意圖

血液是一種復(fù)雜的體液，更確切地說是液體形式中的組織基質(zhì)，通過離心分層血液能夠分成三個(gè)組分（圖1）：血漿層（最上層）、緩沖層（中間層）、紅細(xì)胞層（下層），其中血漿層主要是水(≥90%)，還包括蛋白、血小板、細(xì)胞碎片、EVs，緩沖層包含大部分的血小板和白細(xì)胞，底層為紅細(xì)胞沉淀。EVs在血液中占比極低，其中血液中的外泌體主要來源于血細(xì)胞，其次是與血液接觸的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而來自組織和器官的EVs含量很低，而檢測這類低濃度EVs主要基于EVs生物標(biāo)志物的研究。

圖2 健康人類血液細(xì)胞、EVs、脂蛋白物理特性

二、血液EVs研究的難點(diǎn)

由于血液中存在大量血細(xì)胞，目前血液EVs研究通常以血漿或者血清為起始材料，而研究血漿或血清的EVs亦存在以下難點(diǎn)：

1. 血液中的EVs的產(chǎn)生和清除總是保持平衡，EVs也會(huì)黏附在紅細(xì)胞或管壁被內(nèi)化，因此提取的EVs難以反映血液循環(huán)中的真實(shí)EVs水平；

2. 脂蛋白在大小和/或密度上與EVs重疊，且在血液中含量較高，傳統(tǒng)方法難以分離脂蛋白和EVs；

3. 血小板易被活化，釋放外泌體，改變初始血液中內(nèi)源外泌體組成；

4. 血液中存在非球型或低密度細(xì)胞殘留物，離心后無法與EVs進(jìn)行分離，并且在形態(tài)上也有相似膜結(jié)構(gòu)；

圖3 A為凝血途徑以及血小板激活機(jī)制；B為血細(xì)胞來源EVs檢測

血清樣本血細(xì)胞來源EVs相較于血漿樣本顯著上升。特別凝血過程中導(dǎo)致的血小板激活引起血小板來源EVs含量的上調(diào)；血清中EVs的檢測結(jié)果受血清管類型以及從采血到制備血清的間隔時(shí)間影響。

三、人類血漿和血清制備指南

供血者

1. 匹配對照組：使用在年齡、性別、藥物等方面匹配的對照組進(jìn)行準(zhǔn)確的比較；

2. 采集時(shí)間：如果可能的話，盡量在同一天的同一時(shí)間采集血液，以減小變異；

3. 排除初始血液：排除從EV研究中收集的頭2-3mL血液，使用像EDTA管這樣用于血液學(xué)分析的試管，以避免干擾；

4. 靜脈穿刺指南：遵循臨床靜脈穿刺指南，包括針尺寸、使用停滯法以及監(jiān)測血流直到最后一個(gè)試管，因?yàn)樵谑占鄠€(gè)試管時(shí)血液可能會(huì)激活甚至開始凝結(jié)；

5. 禁食的影響：過夜禁食有助于降低脂蛋白的濃度；

6. 標(biāo)準(zhǔn)化：標(biāo)準(zhǔn)化血樣收集和處理的所有步驟，以減小患者和健康對照之間可能影響血液EV和樣本質(zhì)量的系統(tǒng)差異。

抗凝

1. 抗凝劑的選擇：不同的抗凝劑對凝血和血小板激活有不同的影響。考慮與下游分析的兼容性，例如肝素由于結(jié)合DNA而抑制PCR反應(yīng)；

2. 血小板抑制：一些抗凝劑(ACD、EDTA)有效地抑制血小板激活，從而減少在血液收集和處理過程中釋放的血小板源性EV；

3. 血清與血漿的區(qū)別：認(rèn)識到血清樣本與血漿樣本之間存在差異，尤其是在血小板源性EV方面的影響；

4. 避免混合樣本：不要混合不同抗凝的樣本或血漿和血清樣本。

四、血漿和血清的制備

圖4 血漿、血清制備技術(shù)流程

1. 兩步離心（采集距離白細(xì)胞層或凝塊遠(yuǎn)一些的位置，降低血小板殘留）；

2. 標(biāo)準(zhǔn)化制備程序：血漿血清制備統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化所有獻(xiàn)血者的處理時(shí)間和抗凝劑；

3. 棄掉不透明（含脂肪）、橙色或紅色（溶血），或含有明顯的團(tuán)塊（抗凝不充分）的血漿或血清樣本；

4. 血小板對冷激活敏感，勿將裝有血液的試管放在冰上或冰箱中，應(yīng)在室溫下進(jìn)行所有程序；

5. 盡可能保證使用相同的離心機(jī)、轉(zhuǎn)子、使用條件，建議測量血小板濃度來檢測血漿/血清的質(zhì)量；

6. 使用聚丙烯材料收集血漿，使用玻璃管或者商業(yè)血清收集管收集血清。

研究結(jié)論

這篇文章提出的指南強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化、對供血者變量的謹(jǐn)慎考慮以及適當(dāng)?shù)奶幚沓绦颍源_保從人類血漿和血清中獲得可靠和可重復(fù)的EV研究結(jié)果。