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應用細胞融合技術制備染色體
閱讀：517 發布時間：2017-7-18原代細胞實驗目的
通過細胞融合技術，初步了解染色體提前凝集標本制備原理、方法及間期細胞三種時相的提前凝集染色體特點。
【實驗用品】
一、材料 人宮頸癌上皮細胞(HeLa細胞)
二、器材和儀器 顯微鏡、離心機、水浴箱、熱吹風機、10ml刻度離心管、5(1/2) 針頭注射器、試管架、染色槽、廢液缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、香柏油瓶、記號筆、酒精燈。
三、試劑 50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培養基(含10％滅活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素，0.075mol／L KCl低滲液、2％檸檬酸鈉溶液、0.2％次甲基蘭染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。
【實驗內容】
一、原理
如實驗十一所述，兩個或兩個以上的同種或不同種細胞可以在誘導物的作用下融合成一個細胞。
七十年代初，由于發現M期細胞內有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體技術的基礎上，建立了制備染色體提前凝集標本的方法。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導I期細胞染色質提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。這項技術已應用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復效應的研究，預測某種血液病的病程、愈后及復發的臨床實踐等方面。
二、方法
1．收集培養的M期HeLa細胞 取一瓶處于對數生長期的HeLa細胞，向培養基中加入10μg／ml的秋水仙素使終濃度為0.04μg／ml，在37℃二氧化碳培養箱內繼續培養12小時，使大量生長的細胞被阻斷于M期。每組取一瓶經上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復振搖，使培養液不斷沖涮細胞層(或用吸管吹打)，M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。將含有M期細胞的培養基移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清加人5ml hanks液，用吸管吹打成細胞懸液。
2．收集培養的HeLa細胞 取一瓶生長良好的HeLa細胞，棄去培養基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分鐘，棄去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。
3．50％PEG的制備
稱取0.5g PEG(MW4,000)，倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化(約為0.5ml)，再加入預熱的Hanks液0.5ml混勻，放在37℃水浴中待用。
4.原代細胞融合
(1)將上述l、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。
(2)用指彈法彈散細胞，在37℃水浴條件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入離心管內，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5ml Hanks液以終止PEG的作用。在37℃水浴甲靜置5分鐘。
(3)1000rpm離心5分鐘。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養基，同時用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育
30~60分鐘。
5．制備PCC標本
細胞溫育后，1000rpm離心5分鐘棄去上清，加入10ml 0.075mol／L KCl低滲液輕輕制成懸液。在37℃處理25分鐘左右；終止時加入lml Carnoy固定液進行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，棄去上清留0.2ml，用吸管輕輕吹打成懸液，取預冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。
三、結果觀察
在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導產生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導產生PCC，因此有三種不同形態特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形態特點分別是：
G1期PCC為單線染色體，細長，著色淺呈蓬松的線團狀；S期PCC由于染色體解旋， DNA以多點進行復制，復制后的部分著色較深，以雙線染色體片段形式存在，故呈粉碎穎粒狀結構；G2期PCC因DNA復制完畢，所以可見凝集的雙線染色體，但原代細胞較M期染色體細長。