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產品描述
和元李記EZ Trans一站式慢病毒包裝試劑盒（EZ Trans Lentiviral Infection Kit）包含：慢病毒包裝質粒、對照質粒、轉染試劑（EZ Trans Regent）、慢病毒濃縮液、慢病毒感染增強劑等必要組份，可一站式高效完成病毒包裝到感染細胞的全部過程。和元李記慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Infection Kit）提供足量、優質的對照質粒和包裝質粒，省去實驗人員抽提質粒的工作可快速包裝病毒感染細胞。
和元李記慢病毒載體表達系統由pLenti慢病毒載體和Lentiviral Mix質粒組成。pLenti慢載體中含有HIV基本元件5’LTR和3’LTR以及WPRE等其他輔助元件，表達框為U6-shRNA(NC)-CMV-EGFP-2A-Puro，含綠色熒光和puro真核抗性。客戶可以根據不同的實驗目的針對plenti載體改造用于啟動子、基因功能功能研究，穩定株篩選等。Lentiviral Mix能夠表達病毒包裝需要的各種必需原件，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝系統。
訂購信息
產品名稱 | 貨號 | 規格 |
EZ Trans 一站式慢病毒包裝試劑盒 | AC04L605 | 5T |
EZ Trans 一站式慢病毒包裝試劑盒 | AC04L610 | 10T |
EZ Trans 一站式慢病毒包裝試劑盒 | AC04L620 | 20T |
產品組分
貨號 | 規格 | 組分 | ||||
A:對照質粒 | B:包裝質粒 | C:轉染試劑 | D:感染增強劑 | E:慢病毒濃縮液 | ||
AC04L605 | 5T | 16μL | 110μL | 450μL | 60μL | 12.5mL |
AC04L610 | 10T | 32μL | 220μL | 900μL | 120μL | 25mL |
AC04L620 | 20T | 64μL | 440μL | 1800μL | 240μL | 50mL |
運輸與保存
藍冰運輸。A、B組分-20℃保存，C、D、E組分4℃保存，有效期12個月。
使用方法
一、慢病毒包裝及純化濃縮（以10 cm培養皿為例，1皿為1T）
1. 細胞準備：293T細胞按照6×105cells/mL的細胞密度傳代到10cm培養皿中，第二天細胞長到80%-85%時準備轉染。
2. 轉染前換液：轉染前1h將需要轉染的細胞更換新鮮的DMEM，10mL/皿。
3. 轉染：
(1) 取1.5ml EP管記為質粒混合液（管A），加入500uL DMEM，16μL質粒DNA（可自行改造）和22μL包裝質粒，振蕩混勻；
(2) 另取1.5mL EP管記為轉染試劑混合液（管B），加入500uL DMEM，90μL 轉染試劑，振蕩混勻。
(3) 再將管B緩慢加入到管A中，輕輕混勻，靜置8min形成復合物，后將混合液均勻滴加到提前換好液的10cm培養皿中，輕輕混勻，放入培養箱中培養。
A管 | DMEM | 500μL |
DNA | 16μL | |
包裝質粒 | 22μL | |
B管 | DMEM | 500μL |
轉染試劑 | 90μL |
4. 轉染后換液：轉染后6-8h，將培養皿中的培養基吸掉，棄于廢液杯中，然后加入10mL 培養基（含有血清和抗生素）繼續培養。
5. 病毒收集：轉染48h后，吸取上清液于50mL 離心管中，4000rpm離心10min, 4℃，將上清液用0.45um過濾器過濾轉移到新的50mL 離心管中。此時上清液中的病毒顆粒可以直接去檢測滴度或者感染目的細胞，如果對病毒的滴度及純度有較高要求，可進行后續操作。
6. 病毒濃縮：每10mL 病毒上清液加入2.5mL EZ慢病毒濃縮液（CAT:AC04L442），混勻，4℃放置2h，4000rpm離心30min，吸棄上清。
7. 檢測及分裝：包裝好的病毒可以直接檢測滴度，待用的病毒用EZ病毒保護液重懸分裝凍存。
二、慢病毒感染細胞（以293T細胞為例，MOI值為1）
1. 細胞鋪板：
(1) 將293T細胞配成5×104cells/mL細胞懸液，待鋪板。
(2) 將上述細胞懸液接種到6孔板，每孔鋪2mL，即1×105cells/well。
2. 感染慢病毒：
(1) 鋪好板細胞培養12-20h，準備感染。
(2) 加病毒，計算方法：(細胞數×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒量(μL)，加病毒量見下表。
病毒原液滴度（TU/mL） | MOI =1，10組（μL） |
1×107 | 100 |
1×108 | 10 |
5×108 | 2 |
1×109 | 1 |
2×109 | 0.5 |
(3) 加感染增強劑：每孔加10μL 1mg/mL 感染增強劑，最終在細胞樣品中感染增強劑的終濃度為5μg/mL，輕搖是增強劑分散均勻。
(4) 換液：感染12-20h棄去培養基，每孔加入2mL 新鮮培養基。
3. 觀察：72h后觀察細胞狀態，根據情況做開展后續實驗。（可選）
注意事項
1. 本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。
2. 所有慢病毒操作均應盡量在BSL2*生物安全柜中進行，并佩戴一次性*口罩和手套。
3. 病毒切忌反復凍融，凍融一次病毒滴度降低10%-20%左右。
4. 病毒儲存6個月后，建議在使用前重新測定病毒滴度。
5. 若MOI值高于20時，建議感染增強劑使用體積為8μL/mL，提高轉染效率，一些特殊細胞不能加入感染增強劑。
6. 病毒添加量與待感染細胞MOI值、病毒滴度、目的基因產物對細胞毒性有關，病毒添加量計算方法滿足大多數實驗需要，實驗人員可在此基礎上摸索最佳病毒添加量。
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